Kamis, 11 April 2013


MAKALAH KIMIA BAHAN ALAM
“ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID”
D
I
S
U
S
U
N
OLEH :
RISKA RITONGA (7109050301)
PENDIDIKAN KIMIA SEMSTER 8
UISUFKIP
 







FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS ISLAM SUMATERA UTARA
MEDAN
2013



BAB I
PENDAHULUAN
Senyawa metabolit sekunder merupakan sumber bahan kimia yang tidak akan pernah habis, sebagai sumber inovasi dalam penemuan dan pengembangan obat-obat baru ataupun untuk menujang berbagai kepentingan industri. Hal ini terkait dengan keberadaannya di alam yang tidak terbatas jumlahnya. Dari 250.000 jenis tumbuhan tingkat tinggi seperti dikemukan di atas 54 % diantaranya terdapat di hutan-hutan tropika dan Indonesia dengan hutan tropikanya yang mengandung lebih dari 30.000 jenis tumbuhan tingkat tinggi sangat berpotensial untuk diteliti dan dikembangkan oleh para peneliti Indonesia. 
Indonesia sebagai negara tropis memiliki beraneka ragam tumbuhan yang dapat dimanfaatkan sebanyak-banyaknya untuk kepentingan manusia. Sejak zaman dahulu, masyarakat Indonesia telah mengenal tanaman yang mempunyai khasiat obat atau menyembuhkan berbagai macam penyakit. Saat ini, para peneliti semakin berkembang untuk mengeksplorasi bahan alami yang mempunyai aktivitas biologis yang positif bagi manusia. Berdasarkan beberapa penelitian yang telah dikembangkan, senyawa-senyawa yang memiliki potensi sebagai antioksidan umumnya merupakan senyawa flavonoid, fenolat, dan alkaloid.
            Senyawa yang paling mudah ditemukan adalah flavonoid karena senyawa ini adalah kelompok senyawa fenol terbesar yang ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, biru, dan sebagai zat berwarna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Perkembangan pengetahuan menunjukkan bahwa flavonoid termasuk salah satu kelompok senyawa aromatik yang termasuk polifenol dan mengandung antioksidan. Oleh karena jumlahnya yang melimpah di alam, manusia lebih banyak memanfaatkan senyawa ini dibandingkan dengan senyawa lainnya sebagai antioksidan.
Penelitian bahan alam biasanya dimulai dari ekstraksi, isolasi dengan metode kromatografi sehingga diperoleh senyawa murni, identifikasi unsur dari senyawa murni yang diperoleh dengan metode spektroskopi, dilanjutkan dengan uji aktivitas biologi baik dari senyawa murni ataupun ekstrak kasar. Setelah diketahui struktur molekulnya biasanya dilanjutkan dengan modifikasi struktur untuk mendapatkan senyawa dengan aktivitas dan kestabilan yang diinginka
BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengertian Flavonoid
            Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok fenol yang terbesar yang ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu dan biru dan sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoid merupakan pigmen tumbuhan dengan warna kuning, kuning jeruk, dan merah dapat ditemukan pada buah, sayuran, kacang, biji, batang, bunga, herba, rempah-rempah, serta produk pangan dan obat dari tumbuhan seperti minyak zaitun, teh, cokelat, anggur merah, dan obat herbal. Flavonoid juga dikenal sebagai vitamin P dan citrin, dan merupakan pigmen yang diproduksi oleh sejumlah tanaman sebagai warna pada bunga yang dihasilkan. Bagian tanaman yang bertugas untuk memproduksi flavonoid adalah bagian akar yang dibantu oleh rhizobia, bakteri tanah yang bertugas untuk menjaga dan memperbaiki kandungan nitrogen dalam tanah.
 Senyawa ini berperan penting dalam menentukan warna, rasa, bau, serta kualitas nutrisi makanan. Tumbuhan umumnya hanya menghasilkan senyawa flavonoid tertentu. Keberadaan flavonoid pada tingkat spesies, genus atau familia menunjukkan proses evolusi yang terjadi sepanjang sejarah hidupnya. Bagi tumbuhan, senyawa flavonoid berperan dalam pertahanan diri terhadap hama, penyakit, herbivori, kompetisi, interaksi dengan mikrobia, dormansi biji, pelindung terhadap radiasi sinar UV, molekul sinyal pada berbagai jalur transduksi, serta molekul sinyal pada polinasi dan fertilitas jantan.
            Senyawa flavonoid untuk obat mula-mula diperkenalkan oleh seorang Amerika bernama Gyorgy (1936). Secara tidak sengaja Gyorgy memberikan ekstrak vitamin C (asam askorbat) kepada seorang dokter untuk mengobati penderita pendarahan kapiler subkutaneus dan ternyata dapat disembuhkan. Mc.Clure (1986) menemukan pula oleh bahwa senyawa flavonoid yang diekstrak dari Capsicum anunuum serta Citrus limon juga dapat menyembuhkan pendarahan kapiler subkutan. Mekanisme aktivitas senyawa tersebut dapat dipandang sebagai fungsi “alat komunikasi‟ (molecular messenger) dalam proses interaksi antar sel, yang selanjutnya dapat berpengaruh terhadap proses metabolisme sel atau mahluk hidup yang bersangkutan, baik bersifat negatif (menghambat) maupun bersifat positif (menstimulasi).
                  Flavonoid adalah sekelompok besar senyawa polifenol tanaman yang tersebar luas dalam berbagai bahan makanan dan dalam berbagai konsentrasi. Komponen tersebut pada umumnya terdapat dalam keadaan terikat atau  terkonjugasi dengan senyawa gula. Lebih dari 4000 jenis flavonoid telah diidentifikasi dan beberapa di antaranya berperan dalam pewarnaan bunga, buah,dan daun (de Groot & Rauen, 1998). Dalam tumbuhan, aglikon flavonoid (yaitu flavonoid tanpa gula terikat) terdapat dalam berbagai bentuk struktur.
            Ada juga senyawa-senyawa fenol yang berasal dari kombinasi antara kedua jalur biosintesa ini yaitu senyawa-senyawa flanonoida. Tidak ada benda yang begitu menyolok seperti flavonoida yang memberikan kontribusi keindahan dan kesemarakan pada bunga dan buah-buahan di alam. Flavin memberikan warna kuning atau jingga, antodianin memberikan warna merah, ungu atau biru, yaitu semua warna yang terdapat pada pelangi kecuali warna hijau. Secara biologis flavonoida memainkan peranan penting dalam kaitan penyerbukan tanaman oleh serangga. Sejumlah flavonoida mempunyai rasa pahit sehingga dapat bersifat menolak sejenis ulat tertentu.
            Tidak ada benda yang begitu menyolok seperti flavonoida yang memberikan kontribusi keindahan dan kesemarakan pada bunga dan buah-buahan di alam. Flavin memberikan warna kuning atau jingga, antodianin memberikan warna merah, ungu atau biru, yaitu semua warna yang terdapat pada pelangi kecuali warna hijau. Secara biologis flavonoida memainkan peranan penting dalam kaitan penyerbukan tanaman oleh serangga. Sejumlah flavonoida mempunyai rasa pahit sehingga dapat bersifat menolak sejenis ulat tertentu.
Flavonoid merupakan kelompok senyawa fenolik terbesar yang ditemukan di alam dan berasal dari tumbuhan tingkat tinggi.  Flavonoid mempunyai kerangka dasar dengan 15 atom karbon, dimana dua cincin benzen (C) terikat pada satu rantai propan (C3) sehingga membentuk suatu susunan (C6-C3-C6) dengan struktur 1,3-diarilpropan. Senyawa-senyawa flavonoid terdiri dari beberapa jenis, bergantung pada tingkat oksidasi rantai propan dari sistem 1,3-diarilpropan [Achmad, 1985]. Agar mudah, cincin diberi tanda A, B, dan C,atom karbon dinomori menurut sistem penomoran yang menggunakan angka biasa untuk cincin A dan C, serta angka “beraksen” untuk cincin B.
                Flavonoid adalah senyawa yang tersusun dari 15 atom karbon dan terdiri dari 2 cincin benzen yang dihubungkan oleh 3 atom karbon yang dapat membentuk cincin ketiga. Flavonoid dibagi menjadi 3 macam, yaitu:
  1. Flavonoid yang memiliki cincin ketiga berupa gugus piran. Flavonoid ini disebut flavan atau fenilbenzopiran. Turunan flavan banyak digunakan sebagai astringen (turunan tanin).
  2. Flavonoid yang memiiliki cincin ketiga berupa gugus piron. Flavonoid ini disebut flavon atau fenilbenzopiron. Turunan flavon adalah jenis flavonoid yang paling banyak memiliki aktivitas farmakologi.
  3.  Flavonoid yang memiiliki cincin ketiga berupa gugus pirilium. Flavonoid ini disebut flavilium atau antosian. Turunan pirilium biasa digunakan sebagai pewarna alami


            Kerangka dasar karbon pada flavonoid merupakan kombinasi antara jalur sikhimat dan jalur asetat-malonat yang merupakan dua jalur utama biosintesis cincin aromatik. Cincin A dari struktur flavonoid berasal dari jalur poliketida (jalur asetat-malonat), yaitu kondensasi tiga unit asetat atau malonat, sedangkan cincin B dan tiga atom karbon dari rantai propan berasal dari jalur fenilpropanoid (jalur sikhimat) [Achmad, 1985].
 









              
            Modifikasi flavonoid lebih lanjut, dapat mungkin terjadi pada berbagai tahap dan menghasilkan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil, metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoid, isoprenilasi gugus hidroksil atau inti flavonoid, metilenasi gugus orto-dihidroksil, dimerisasi (pembentukan biflavonoid), pembentukan bisulfat, dan yang terpenting adalah glikosilasi gugus hidroksil(pembentukan flavonoid O-glikosida) atau inti flavonoid (pembentukanflavonoid C-glikosida) (Markham, 1988).
Markham (1988) menyatakan bahwa flavonoid pertama yang dihasilkan pada alur biosintesis flavonoid ialah khalkon, dan semua turunan flavon diturunkan darinya melalui berbagai alur. Semua golonganflavonoid saling berkaitan, karena berasal dari alur biosintesis yangsama. Cincin A terbentuk karena kondensasi ekor-kepala dari tiga unit asam asetat-malonat atau berasal dari jalur poliketida. Cincin B serta satuan tiga atom karbon dari rantai propan yang merupakan kerangka dasar C6 – C3 berasal dari jalurasam sikimat (Manitto, 1981).
Polifenol dan turunannya telah lama dikenal memiliki aktivitas antibakteri, antimelanogenesis, antioksidan dan antimutagen. Sebagai antioksidan polifenol berperan sebagai penangkap radikal bebas penyebab peroksidasi lipid yang dapat menimbulkan kerusakan pada bahan makanan, selain itu senyawa antioksidan berfungsi mencegah kerusakan sel dan DNA akibat adanya senyawa radikal bebas.  Senyawa flavonoid yang merupakan salah satu golongan dari polifenol sampai saat ini belum dimanfaatkan secara optimal dan masih digunakan secara terbatas. Hal ini dikarenakan senyawa flavonoid tidak stabil terhadap perubahan pengaruh oksidasi, cahaya, dan perubahan kimia, sehingga apabila teroksidasi strukturnya akan berubah dan fungsinya sebagai bahan aktif akan menurun bahkan hilang dan kelarutannya rendah. Kestabilan dan kelarutan dapat ditingkatkan dengan cara mengubah senyawa flavonoid menjadi bentuk glikosida melalui reaksi kimia maupun enzimatik dengan bantuan enzim transferase. Senyawa-senyawa flavanoid yang umumnya bersifat antioksidan dan banyak yang telah digunakan sebagai salah satu komponen bahan baku obat-obatan. Bahkan, berdasarkan penelitian di Jepang, ditemukan molekul isoflavon di dalam tempe. Oleh karena molekul isoflavon bersifat antioksidan maka tempe merupakan sumber pangan yang baik untuk menjaga kesehatan, selain kandungan gizinya tinggi.


B. Struktur Flavonoid:
 




Istilah flavonoida diberikan untuk senyawa-senyawa fenol yang berasal dari kata flavon, yaitu nama dari salah satu flavonoid yang terbesar jumlahnya dalam tumbuhan. Senyawa-senyawa flavon ini mempunyai kerangka 2-fenilkroman, dimana posisi orto dari cincin A dan atom karbon yang terikat pada cincin B dari 1.3-diarilpropana dihubungkan oleh jembatan oksigen sehingga membentuk cincin heterosiklik yang baru (cincin C).
Senyawa-senyawa flavonoid terdiri dari beberapa jenis tergantung pada tingkat oksidasi dari rantai propana dari sistem 1,3-diarilpropana. Flavon, flavonol dan antosianidin adalah jenis yang banyak ditemukan dialam sering sekali disebut sebagai flavonoida utama. Banyaknya senyawa flavonoida ini disebabkan oleh berbagai tingkat alkoksilasi atau glikosilasi dari struktur tersebut. Senyawa-senyawa isoflavonoid dan neoflavonoida hanya ditemukan dalam beberapa jenis tumbuhan, terutama suku Leguminosae.
Pola biosintesis pertama kali disarankan oleh Birch, yaitu : pada tahap tahap pertama biosintesa flavonoida suatu unit C6-C3 berkombinasi dengan tiga unit C2 menghasilkan unit C6-C3-(C2+C2+C2).kerangka C15 yang dihasilkan dari kombinasi ini telah mengandung gugus-gugus fungsi oksigen pada posisi-posisi yang diperlukan. Cincin A dari struktur flavonoida berasal dari jalur poliketida, yaitu kondensasi dari tiga unit asetat atau malonat, sedangkan cincin B dan tiga atom karbon dari rantai propana berasal dari jalur fenilpropanoida (jalur shikimat). Sehingga kerangka dasar karbon dari flavonoida dihasilkan dari kombinasi antara dua jenis biosintes utamadari cincin aromatik yaitu jalur shikimat dan jalur asetat-malonat. Sebagai akibat dari berbagai perubahan yang disebabkan oleh enzim, ketiga atom karbon dari rantai propana dapat menghasilkan berbagai gugus fungsi seperti pada ikatan rangkap, gugus hidroksi, gugus karbonil, dan sebagainya. Sebagai besar senyawa flavonoida alam ditemukan dalam bentuk glikosida, dimana unit flavonoid terikat pada sutatu gula. Glikosida adalah kombinasi antara suatu gula dan suatu alkohol yang saling berikatanmelalui ikatan glikosida. Pada prinsipnya, ikatan glikosida terbentuk apabila gugus hidroksil dari alkohol beradisi kepada gugus karbonil dari gula sama seperti adisi alkohol kepada aldehida yang dikatalisa oleh asam menghasilkan suatu asetal.
Pada hidrolisa oleh asam, suatu glikosida terurai kembali atas komponen-komponennya menghasilkan gula dan alkohol yang sebanding dan alkohol yang dihasilkan ini disebut aglokin. Residu gula dari glikosida flavonoida alam adalah glukosa, ramnosa, galaktosa dan gentiobiosa sehingga glikosida tersebut masing-masing disebut glukosida, ramnosida, galaktosida dan gentiobiosida.  Flavonoida dapat ditemukan sebagai mono-, di- atau triglikosida dimana satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan sedikit larut dalam pelarut organik seperti eter, benzen, kloroform dan aseton. Antioksidan alami terdapat dalam bagian daun, buah, akar, batang dan biji dari tumbuh-tumbuhan obat. Bagian tersebut umumnya mengandung senyawa fenol dan polifenol.
Beberapa contoh flavonoid:
 












Flavonoid (terutama glikosida) mudah mengalami degradasi enzimatik ketika dikoleksi dalam bentuk segar. Oleh karena itu disarankan koleksi yang dikeringkan atau dibekukan. Ekstraksi menggunakan solven yang sesuai dengan tipe flavonoid yg dikehendaki. Polaritas menjadi pertimbangan utama. Flavonoid kurang polar (seperti isoflavones, flavanones, flavones termetilasi, dan flavonol) terekstraksi dengan chloroform, dichloromethane, diethyl ether, atau ethyl acetate, sedangkan flavonoid glycosides dan aglikon yang lebih polar terekstraksi dengan alcohols atau campuran alcohol air. Glikosida meningkatkan kelarutan ke air dan alkohol-air.
C. Klasifikasi Senyawa Flavonoid
            Flavonoid merupakan metabolit sekunder yang paling beragam dan tersebar luas. Sekitar 5-10% metabolit sekunder tumbuhan adalah flavonoid, dengan struktur kimia dan peran biologi yang sangat beragam Senyawa ini dibentuk dari jalur shikimate dan fenilpropanoid, dengan beberapa alternatif biosintesis. Flavonoid banyak terdapat dalam tumbuhan hijau (kecuali alga), khususnya tumbuhan berpembuluh. Flavonoid sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nectar, bunga, buah buni dan biji. Kira-kira 2% dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuh-tumbuhan diubah menjadi flavonoid. Flavonoid merupakan turunan fenol yang memiliki struktur dasar fenilbenzopiron (tokoferol), dicirikan oleh kerangka 15 karbon (C6-C3-C6) yang terdiri dari satu cincin teroksigenasi dan dua cincin aromatis. Substitusi gugus kimia pada flavonoid umumnya berupa hidroksilasi, metoksilasi, metilasi dan glikosilasi.
Klasifikasi flavonoid sangat beragam, di antaranya ada yang mengklasifikasikan flavonoid menjadi flavon, flavonon, isoflavon, flavanol, flavanon, antosianin, dan kalkon. Lebih dari 6467 senyawa flavonoid telah diidentifikasi dan jumlahnya terus meningkat. Kebanyakan flavonoid berbentuk monomer, tetapi terdapat pula bentuk dimer (biflavonoid), trimer, tetramer, dan polimer. Istilah flavonoid diberikan untuk senyawa-senyawa fenol yang berasal dari kata flavon, yaitu nama dari salah satu flavonoida yang terbesar jumlahnya dalam tumbuhan.
Masing-masing jenis senyawa flavonoida mempunyai struktur dasar tertentu. Flavonoida mempunyai pola oksigenasi yang berselang-seling yaitu posisi 2,4,6. cincin B flavonoid mempunyai satu gugus fungsi oksigen pada posisi para atau dua pada posisi para dan meta atau tiga pada posisi satu di para dan dua di meta. Cincin A selalu mempunyai gugus hidroksil yang letaknya sedemikian rupa sehingga memberikan kemungkinan untuk terbentuk cincin heterosikllis dalam senyawa trisiklis. Beberapa senyawa flavonoida adalah sebagai berikut :
Cincin A – COCH2CH2 – Cincin B —————————– Hidrokalkon
Cincin A – COCH2CHOH – Cincin B ————————– Flavanon, kalkon
Cincin A – COCH2CO – Cincin B —————————— Flavon
Cincin A – CH2COCO – Cincin B —————————— Antosianin
Cincin A – COCOCH2 – Cincin B ——————————- Auron

Senyawa-senyawa flavonoid terdiri dari beberapa jenis tergantung pada tingkat oksidasi dari rantai propane dari system 1,3-diarilpropana. Flavon, flavonol dan antosianidin adalah jenis yang banyak ditemukan di alam sehingga sering disebut sebagai flavonoida utama. Banyaknya senyawa flavonoida ini disebabkan oleh berbagai tingkat hidroksilasi, alkoksilasi atau glikosilasi dari struktur tersebut. Senyawa-senyawa isoflavonoida dan neoflavonoida hanya ditemukan dalam beberapa jenis tumbuhan, terutama suku leguminosae. Masing-masing jenis senyawa flavonoida mempunyai struktur dasar tertentu. Flavonoida mempunyai beberapa cirri struktur yaitu: cincin A dari struktur flavonoida mempunyai pola oksigenasi yang berselang-seling yaitu pada posisi 2,4 dan 6. Cincin B flavonoida mempunyai satu gugus fungsi oksigen pada posisi para atau dua pada posisi para dan meta aau tiga pada posisi satu di para dan dua di meta. Cincin A selalu mempunyai gugus hidroksil yang letaknya sedemikian rupa sehingga memberikan kemungkinan untuk terbentuk cincin heterosiklik dalam senyawa trisiklis. Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantaipropana (C3) sehingga membentuk suatu susunan C6-C3-C6. Susunan ini dapat menghasilkan tiga jenis struktur senyawa flavonoida, yaitu:
1.    Flavonoida atau 1,3-diarilpropana
             Beberapa senyawa flavonoida yang ditemukan di alam adalah sebagai berikut
a) Antosianin
                  Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam tumbuhan. Secara kimia antosianin merupakan turunan suatu struktur aromatik tunggal, yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau dengan metilasi. Antosianin tidak mantap dalam larutan netral atau basa. Karena itu antosianin harus diekstraksi dari tumbuhan dengan pelarut yang mengandung asam asetat atau asam hidroklorida (misalnya metanol yang mengandung HCl pekat 1%) dan larutannya harus disimpan di tempat gelap serta sebaiknya didinginkan. Antosianidin ialah aglikon antosianin yang terbentuk bila antosianin dihidrolisis dengan asam. Antosianidin terdapat enam jenis secara umum, yaitu : sianidin, pelargonidin, peonidin, petunidin, malvidin dan delfinidin.
                  Antosianidin adalah senyawa flavonoid secara struktur termasuk kelompok flavon. Glikosida antosianidin dikenal sebagai antosianin. Nama ini berasal dari bahasa Yunani antho-, bunga dan kyanos-, biru. Senyawa ini tergolong pigmen dan pembentuk warna pada tanaman yang ditentukan oleh pH dari lingkungannya. Senyawa paling umum adalah antosianidin, sianidin yang terjadi dalam sekitar 80 persen dari pigmen daun tumbuhan, 69 persen dari buah-buahan dan 50 persen dari bunga. Kebanyakan warna bunga merah dan biru disebabkan antosianin. Bagian bukan gula dari glukosida itu disebut suatu antosianidin dan merupakan suatu tipe garam flavilium. Warna tertentu yang diberikan oleh suatu antosianin, sebagian bergantung pada pH bunga. Warna biru bunga cornflower dan warna merah bunga mawar disebabkan oleh antosianin yang sama, yakni sianin. Dalam sekuntum mawar merah, sianin berada dalam bentuk fenol. Dalam cornflower biru, sianin berada dalam bentuk anionnya, dengan hilangnya sebuah proton dari salah satu gugus fenolnya. Dalam hal ini, sianin serupa dengan indikator asam-basa. Istilah garam flavilium berasal dari nama untuk flavon, yang merupakan senyawa tidak berwarna. Adisi gugus hidroksil menghasilkan flavonol, yang berwarna kuning.
            Dalam pengidentifikasian antosianin atau flavonoid yang kepolarannya rendah, daun segar atau daun bunga jangan dikeringkan tetapi harus digerus dengan MeOH. Ekstraksi hampir segera terjadi seperti terbukti dari warna larutan. Flavonoid yang kepolarannya rendah dan yang kadang-kadang terdapat pada bagian luar tumbuhan, paling baik diisolasi hanya dengan merendam bahan tumbuhan segar dalam heksana atau eter selama beberapa menit.
Antosianin secara umum mempunyai stabilitas yang rendah. Pada pemanasan yang tinggi, kestabilan dan ketahanan zat warna antosianin akan berubah dan mengakibatkan kerusakan. Selain mempengaruhi warna antosianin, pH juga mempengaruhi stabilitasnya, dimana dalam suasana asam akan berwarna merah dan suasana basa berwarna biru. Antosianin lebih stabil dalam suasana asam daripada dalam suasana alkalis ataupun netral. Zat warna ini juga tidak stabil dengan adanya oksigen dan asam askorbat. Asam askorbat kadang melindungi antosianin tetapi ketika antosianin menyerap oksigen, asam askorbat akan menghalangi terjadinya oksidasi. Pada kasus lain, jika enzim menyerang asam askorbat yang akan menghasilkan hydrogen peroksida yang mengoksidasi sehingga antosianin mengalami perubahan warna. Warna pigmen antosianin merah, biru, violet, dan biasanya dijumpai pada bunga, buah-buahan dan sayur-sayuran.
Dalam tanaman terdapat dalam bentuk glikosida yaitu membentuk ester dengan monosakarida (glukosa, galaktosa, ramnosa dan kadang-kadang pentosa). Sewaktu pemanasan dalam asam mineral pekat, antosianin pecah menjadi antosianidin dan gula. Pada pH rendah (asam) pigmen ini berwarna merah dan pada pH tinggi berubah menjadi violet dan kemudian menjadi biru. Pada umumnya, zat-zat warna distabilkan dengan penambahan larutan buffer yang sesuai. Jika zat warna tersebut memiliki pH sekitar 4 maka perlu ditambahkan larutan buffer asetat, demikian pula zat warna yang memiliki pH yang berbeda maka harus dilakukan penyesuaian larutan buffer. Warna merah bunga mawar dan biru pada bunga jagung terdiri dari pigmen yang sama yaitu sianin. Perbedaannya adalah bila pada bunga mawar pigmennya berupa garam asam sedangkan pada bunga jagung berupa garam netral. Konsentrasi pigmen juga sangat berperan dalam menentukan warna.
 Pada konsentrasi yang encer antosianin berwarna biru, sebaliknya pada konsentrasi pekat berwarna merah dan konsentrasi biasa berwarna ungu. Adanya tanin akan banyak mengubah warna antosianin. Dalam pengolahan sayur-sayuran adanya antosianin dan keasaman larutan banyak menentukan warna produk tersebut. Misalnya pada pemasakan bit atau kubis merah. Bila air pemasaknya mempunyai pH 8 atau lebih (dengan penambahan soda) maka warna menjadi kelabu violet tetapi bila ditambahkan cuka warna akan mejadi merah terang kembali. Tetapi jarang makanan mempunyai pH yang sangat tinggi. Dengan ion logam, antosianin membentuk senyawa kompleks yang berwarna abu-abu violet. Karena itu pada pengalengan bahan yang mengandung antosianin, kalengnya perlu mendapat lapisan khusus (lacquer).

b) Flavonol
                  Flavonol lazim sebagai konstituen tanaman yang tinggi, dan terdapat dalam berbagai bentuk terhidroksilasi. Flavonol alami yang paling sederhana adalah galangin, 3,5,7 –tri-hidroksiflavon; sedangkan yang paling rumit, hibissetin adalah 3,5,7,8,3’,4’,5’ heptahidroksiflavon. Bentuk khusus hidroksilasi (C6(A)-C3-C6(B), dalam mana C6 (A) adalah turunan phloroglusional, dan cincin B adalah 4-atau 3,4-dihidroksi, diperoleh dalam 2 flavonol yang paling lazim yaitu kaempferol dan quirsetin. Hidroksiflavonol, seperti halnya hidroksi flavon, biasanya terdapat dalam tanaman sebagai glikosida. Flavonol kebanyakan terdapat sebagai 3-glikosida. Meskipun flavon, flavonol, dan flavanon pada umumnya terdistribusi melalui tanaman tinggi tetapi tidak terdapat hubungan khemotakson yang jelas. Genus Melicope mengandung melisimpleksin dan ternatin, dan genus citrus mengandung nobiletin, tangeretin dan 3’,4’,5,6,7-pentametoksiflavon.
                                                                      




c)  Flavonon
d)  Khalkon
            Polihidroksi khalkon terdapat dalam sejumlah tanaman, namun terdistribusinya di alam tidak lazim. Alasan pokok bahwa khalkon cepat mengalami isomerasi menjadi flavanon dalam satuan keseimbangan. Bila khalkon 2,6-dihidroksilasi, isomer flavanon mngikat 5 gugus hidroksil, dan stabilisasi mempengaruhi ikatan hydrogen 4-karbonil-5-hidroksil maka menyebabkan keseimbangan khalkon-flavon condong ke arah flavanon. Hingga khalkon yang terdapat di alam memiliki gugus 2,4-hidroksil atau gugus 2-hidroksil-6-glikosilasi.
            Beberapa khalkon misalnya merein, koreopsin, stillopsin, lanseolin yang terdapat dalam tanaman, terutama sebagai pigmen daun bunga berwarna kuning, kebanyakan terdapat dalam tanaman Heliantheaetribe, Coreopsidinae subtribe, dan family Compositea.

e)  Auron (Cincin A –COCO CH2 – Cincin B)
            Auron atau system cincin benzalkumaranon dinomori sebagai berikut :
1)  Dihidrokhalkon.
            Meskipun dihidrokhalkon jarang terdapat di alam, namun satu senyawa yang penting yaitu phlorizin merupakan konstituen umum family Rosaceae juga terdapat dalam jenis buah-buahan seperti apel dan pear. Phlorizin telah lama dikenal dalam bidang farmasi, ia memiliki kesanggupan menghasilkan kondisi seperti diabetes. Phlorizin merupakan β-D-glukosida phloretin. Phloretin mudah terurai oleh alkali kuat menjadi phloroglusional dan asam p-hidroksihidrosinamat. Jika glukosida phlorizin dipecah dengan alkali dengan cara yang sama, maka ternyata sisa glukosa tidak dapat terlepas dan dihasilkan phloroglusinol β-O-glukosida.

f)       Flavon
            Flavon mudah dipecah oleh alkali menghasilkan diasil metan atau tergantung pada kondisi reaksi, asam benzoate yang diturunkan dari cincin A. flavon stabil terhadap asam kuat dan eternya mudah didealkilasi dengan penambahan HI atau HBr, atau dengan aluminium klorida dalam pelarut inert. Namun demikian, selama demetilasi tata ulang sering teramati; oleh pengaruh asam kuat dapat menyebabkan pembukaan cincin pada cara yang lain. Sebagai contoh demetilasi 5,8-dimetoksiflavon dengan HBr dalam asam asetat menghasilkan 5,6 dihidroksiflavon . Dalam keadaan khusus pembukaan lanjut dapat terjadi.
            Demetilasi gugus 5-metoksi dalam polimetoksiflavon segera terjadi pada kondisi yang cocok, sehingga 5-hidroksi-polimetoksiflavon mudah dibuat.
2.    Isoflavonoida atau 1,2-diarilpropana.
            Isoflavon terdiri atas struktur dasar C6-C3-C6, secara alami disintesa oleh tumbuh-tumbuhan dan senyawa asam amino aromatik fenilalanin atau tirosin. Biosintesa tersebut berlangsung secara bertahap dan melalui sederetan senyawa antara yaitu asam sinnamat, asam kumarat, calkon, flavon dan isoflavon. Berdasarkan biosintesa tersebut maka isoflvon digolongkan sebagai senyawa metabolit sekunder. Isoflavon termasuk dalam kelompok flavonoid (1,2-diarilpropan) dan merupakan kelompok yang terbesar dalam kelompok tersebut.  Meskipun isoflavon merupakan salah satu metabolit sekunder, tetapi ternyata pada mikroba seperti bakteri, algae, jamur dan lumut tidak mengandung isoflavon, karena mikroba tersebut tidak mempunyai kemampuan untuk mensintesanya. Jenis senyawa isoflavon di alam sangat bevariasi. Diantaranya telah berhasil diidentifikasi struktur kimianya dan diketahui fungsi fisiologisnya, misalnya isoflavon, rotenoid dan kumestan, serta telah dapat dimanfaatkan untuk obat-obatan.

3. Neoflavonoida atau 1,1-diarilpropana
            Neoflavonoid meliputi jenis-jenis 4-arilkumarin dan berbagai dalbergoin. Penggolongan Flavonoid Berdasarkan Jenis Ikatan
a. Flavonoid O-Glikosida
            Pada senyawa ini gugus hidroksil flavonoid terikat pada satu gula atau lebih dengan ikatan hemiasetal yang tidak tahan asam, pengaruh glikosida ini nenyebabkan flavonoid kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air. Gula yang paling umum terlibat adalah glukosa disamping galaktosa, ramilosa, silosa, arabinosa, fruktosa dan kadang-kadang glukoronat dan galakturonat. Disakarida juga dapat terikat pada flavonoid misalnya soforosa, gentibiosa, rutinosa dan lain-lain.

b. Flavonoid C-Glikosida
            Gugus gula terikat langsung pada inti benzen dengan suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam. Lazim di temukan gula terikat pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoid. Jenis gula yang terlibat lebih sedikit dibandingkan dengan O-glikosida. Gula paling umum adalah galaktosa, raminosa, silosa, arabinosa.



c. Flavonoid Sulfat
            Senyawa flavonoid yang mengandung satu ion sulfat atau lebih yang terikat pada OH fenol atau gula, Secara teknis termasuk bisulfate karena terdapat sebagai garam yaitu flavon O-SO3K. Banyak berupa glikosida bisulfat yang terikat pada OH fenol yang mana saja yang masih bebas atau pada guIa. Umumnya hanya terdapat pada Angiospermae yang mempunyai ekologi dengan habitat air.

d.Biflavonoid
Senyawa ini mula-mula ditemukan oleh Furukawa dari ekstrak daun G. biloba berupa senyawa berwarna kuning yang dinamai ginkgetin (I-4’, I-7-dimetoksi, II-4’, I-5, II-5, II-7-tetrahidroksi [I-3’, II-8] biflavon). Biflavonoid (atau biflavonil, flavandiol) merupakan dimer flavonoid yang dibentuk dari dua unit flavon atau dimer campuran antara flavon dengan flavanon dan atau auron. Struktur dasar biflavonoid adalah 2,3-dihidroapigeninil-(I- 3′,II-3′)-apigenin. Senyawa ini memiliki ikatan interflavanil C-C antara karbon C-3′ pada masing-masing flavon. Beberapa biflavonoid dengan ikatan interflavanil C- O-C juga ada. Biflavonoid terdapat pada buah, sayuran, dan bagian tumbuhan lainnya.. Hingga kini jumlah biflavonoid yang diisolasi dan dikarakterisasi dari alam terus bertambah, namun yang diketahui bioaktivitasnya masih terbatas. Biflavonoid yang paling banyak diteliti adalah ginkgetin, isoginkgetin, amentoflavon, morelloflavon, robustaflavon, hinokiflavon, dan ochnaflavon. Senyawa- senyawa ini memiliki struktur dasar yang serupa yaitu 5,7,4’-trihidroksi flavanoid, tetapi berbeda pada sifat dan letak ikatan antar flavanoid
            Sistem cincin bisiklis dinamai cincin A dan C, sedangkan cincin unisiklis dinamai cincin B. Kedua unit monomer biflavonoid ditandai dengan angka Romawi I dan II. Posisi angka pada masing-masing monomer dimulai dari cincin yang mengandung atom oksigen, posisi ke-9 dan ke-10 menunjukkan karbon pada titik penyatuan Senyawa biflavonóid berperan sebagai antioksidan, anti-inflamasi, anti kanker, anti alergi, antimikrobia, antifungi, antibakteri, antivirus, pelindung terhadap iradiasi UV, vasorelaksan, penguat jantung, anti hipertensi, anti pembekuan darah, dan mempengaruhi metabolisme enzim. Sebagian besar peran di atas dapat dipenuhi oleh berbagai senyawa biflavonoid yang diekstraksi dari berbagai spesies Selaginella.
            Seperti yang telah dikemukakan di atas biflavonoid merupakan flavonoid dimer yang biasanya terlibat adalah flavon dan flavonon yang secara biosintesis mempunyai pola oksigenasi yang sederhana, 5, 7, 4' dan ikatan antar flavonoid berupa C-C atau eter. Biflavonoid jarang ditemukan sebagai glikosida dan penyebarannya terbatas umumnya pada paku-pakuan, Gimnospermae, Angiospermae. Salah satu struktur flavonoid yang bernilai tinggi sebagai bahan obat adalah biflavonoid. Di Asia Timur biflavonoid banyak dihasilkan dari daun Ginkgo biloba L. dengan kandungan utama ginkgetin Di Afrika sub Sahara biflavonoid banyak dihasilkan dari biji Garcinia cola Heckel dengan kandungan utama kolaviron. Di Eropa biflavonoid banyak dihasilkan dari herba Hypericum perforatum L. dengan kandungan utama amentoflavon. Selaginella Pal. Beauv. (Selaginellaceae Reichb.) sangat berpotensi sebagai sumber biflavonoid. Tumbuhan ini dapat menghasilkan berbagai jenis biflavonoid, tergantung spesiesnya, serta memiliki sebaran yang bersifat kosmopolitan sehingga dapat dibudidayakan hampir di seluruh permukaan bumi.

D. Sifat Flavonoid
      1. Sifat Fisika dan Kimia Senyawa Flavonoid
            Flavonoid merupakan senyawa polifenol sehingga bersifat kimia senyawa fenol yaitu agak asam dan dapat larut dalam basa, dan karena merupakan senyawa polihidroksi (gugus hidroksil) maka juga bersifat polar sehingga dapat larut dalan pelarut polar seperti metanol, etanol, aseton, air, butanol, dimetil sulfoksida, dimetil formamida. Disamping itu dengan adanya gugus glikosida yang terikat pada gugus flavonoid sehingga cenderung menyebabkan flavonoid mudah larut dalam air. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, biru, dan sebagai zat berwarna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Perkembangan pengetahuan menunjukkan bahwa flavonoid termasuk salah satu kelompok senyawa aromatik yang termasuk polifenol dan mengandung antioksidan.
Aglikon flavonoid adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih, atau suatu gula, flavonoid merupakan senyawa polar dan seperti kata pepatah lama suatu golongan akan melarutkan golongannya sendiri, maka umumnya flavonoid larut cukupan dalam 11 pelarut polar seperti etanol (EtOH), metanol (MeOH), butanol (BuOH), aseton, dimetilsulfoksida (DMSO), dimetilformamida (DMF), air, dan lain-lain. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).
            Flavonoid juga memiliki beberapa sifat seperti hepatoprotektif, antitrombotik, antiinflamasi, dan antivirus (Stavric dan Matula, 1992). Sifat antiradikal flavonoid terutama terhadap radikal hidroksil, anionsuperoksida, radikal peroksil, dan alkoksil (Huguet, et al., 1990; Sichel,et al.,1991). Senyawa flavonoid ini memiliki afinitas yang sangat kuat terhadap ion Fe (Fe diketahui dapat  mengkatalisis beberapa proses yang  menyebabkan terbentuknya radikal bebas). Aktivitas antiperoksidatif flavonoid ditunjukkan melalui potensinya sebagai pengkelat Fe (Afanasav,et al., 1989 ; Morel,et al.,1993).
            Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka dapat diekstraksi dengan etanol 70 % dan tetap ada dalam lapisan air setelah ekstrak inidikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena ituwarnanya berubah bila ditambah basa atau amonia, jadi mereka mudah dideteksipada kromatogram atau dalam larutan (Harborne, 1987 : 70).
Sifat-sifat kimia dari senyawa fenol adalah sama, akan tetapi dari segi biogenetic senyawa senyawa ini dapat dibedakan atas dua jenis utama, yaitu:
1.      Senyawa fenol yang berasal dari asam shikimat atau jalur shikimat.
2.      Senyawa fenol yang berasal dari jalur asetat-malonat.
            Ada juga senyawa-senyawa fenol yang berasal dari kombinasi antara kedua jalur biosintesa ini yaitu senyawa-senyawa flanonoida. Tidak ada benda yang begitu menyolok seperti flavonoida yang memberikan kontribusi keindahan dan kesemarakan pada bunga dan buah-buahan di alam. Flavin memberikan warna kuning atau jingga, antodianin memberikan warna merah, ungu atau biru, yaitu semua warna yang terdapat pada pelangi kecuali warna hijau. Secara biologis flavonoida memainkan peranan penting dalam kaitan penyerbukan tanaman oleh serangga. Sejumlah flavonoida mempunyai rasa pahit sehingga dapat bersifat menolak sejenis ulat tertentu.

           


2. Sifat Kelarutan Flavonoid
            Aglikon flavonoid adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa, tetapi bila dibiarkan dalam larutan basa dan di samping itu terdapat oksigen, banyak yang akan terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih,atau suatu gula, flavonoid merupakan senyawa polar, maka umumnya flavonoidcukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetil-sulfoksida, dimetilformamida, air, dan lain-lain (Markham, 1988 : 15).Adanya gula yang terikat pada flavonoid (bentuk umum yang ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut di atas dengan air merupakan pelarut yang baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, danflavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988 : 15). Kelarutan flavonoid antara lain :
1. Flavonoid polimetil atau polimetoksi larut dalam heksan, petroleum eter (PE), kloroform, eter, etil asetat, dan etanol. Contoh: sinersetin (nonpolar).
2. Aglikon flavonoid polihidroksi tidak larut dalam heksan, PE dan kloroform; larut dalam eter, etil asetat dan etanol; dan sedikit larut dalam air. Contoh: kuersetin (semipolar).
3. Glikosida flavonoid tidak larut dalam heksan, PE, kloroform, eter; sedikit larut dalam etil asetat dan etanol; serta sangat larut dalam air. Contoh: rutin.
3. Kestabilan Flavonoid
            Secara fisis, flavonoid bersifat stabil. Namun, secara kimiawi ada 2 jenis flavonoid yang kurang stabil, yaitu:
  1. Flavonoid O-glikosida; dimana glikon dan aglikon dihubungkan oleh ikatan eter (R-O-R).  Flavonoid jenis ini mudah terhidrolisis.
  2. Flavonoid C-glikosida; dimana glikon dan aglikon dihubungkan oleh ikatan C-C. Flavonoid jenis ini sukar terhidrolisis, tapi mudah berubah menjadi isomernya. Misalnya viteksin, dimana gulanya mudah berpindah ke posisi 8. Perlu diketahui, kebanyakan gula terikat pada posisi 5 dan 8, jarang terikat pada cincin B atau C karena kedua cincin tersebut berasal dari jalur sintesis tersendiri, yaitu jalur sinamat.

E. Sumber Flavonid
Flavonoid tersebar luas pada tumbuhan tapi jarang terdapat pada bakteri, jamur dan lumut. Dalam dunia tumbuhan, flavonoid tersebar luas dalam suku Rutaceae, Papilionaceae (kacang-kacangan), Labiatae (Ortosiphon), Compositae (contoh: Sonchus arvensis), Anacardiaceae, Apiaceae/Umbeliferae (seledri, pegagan, wortel), dan Euphorbiaceae (contoh: daun singkong). Pada tingkat organ, flavonoid tersebar pada seluruh bagian tanaman seperti biji, bunga, daun, dan batang. Pada tingkat jaringan, flavonoid banyak terdapat pada jaringan palisade. Pada tingkat seluler, flavonoid bisa terdapat pada dinding sel, kloroplas, atau terlarut dalam sitoplasma. Pada paku-pakuan, flavonoidnya berupa flavonoid polimetoksi sehingga hanya terdapat pada dinding sel dan tidak terdapat pada sitoplasma karena sitoplasma mengandung banyak air sehingga bersifat polar dan tidak dapat melarutkan flavonoid polimetoksi.
            Flavonoid sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepungsari, nektar, bunga, buah dan biji. Hanya sedikit catatan yang melaporkan flavonoid pada hewan, misalnya dalam kelenjar bau berang-berang, propilis (sekresi lebah), sayap kupu-kupu, yang mana dianggap bukan hasil biosintesis melainkan dari tumbuhan yang menjadi makanan hewan tersebut, Senyawa antosianin sering dihubungkan dengan warna bunga tumbuhan. Sianidin umumnya terdapat pada suku Gramineae. Senyawa biflavonoid banyak terdapat pada subdivisi Gymnospernae sedang isoflavonoid pada suku leguminosae. Pada tumbuhan yang mempunyai morfologi sederhana seperti lumut, paku, dan paku ekor kuda mengandung senyawa flavonoid O-GIikosida, flavonol, flavonon, Khalkon, dihidrokhalkon, C-Gl ikosida . Angiospermae mengandung senyawa flavonoid kompleks yang lebih banyak.
            Flavonoid adalah pigmen tumbuhan yang paling penting untuk warna bunga yang memproduksi pigmentasi kuning atau merah/biru di kelopak yang dirancang untuk menarik pollinator hewan. Flavonoid dikeluarkan oleh akar tanaman bantuan host mereka ” Rhizobia” dalam tahap infeksi mereka hubungan simbiotik dengan kacang-kacangan seperti kacang polong, kacang, Semanggi, dan kedelai. Rhizobia yang tinggal di tanah dapat merasakan flavonoid dan ini memicu sekresi mengangguk faktor, yang pada gilirannya diakui oleh tanaman dan dapat menyebabkan akar rambut deformasi dan beberapa tanggapan selular seperti ion fluks dan pembentukan nodul akar. Mereka juga melindungi tanaman dari serangan dengan mikroba, jamur dan serangga.
            Flavonoid (khusus flavnoids seperti catechin) adalah “kelompok yang paling umum polyphenolic senyawa dalam makanan manusia dan ubiquitously ditemukan pada tanaman”. Flavonols, bioflavonoids asli seperti quercetin, yang juga ditemukan ubiquitously, tetapi dalam jumlah yang lebih rendah. Kedua set senyawa memiliki bukti modulasi kesehatan efek pada hewan yang makan mereka.
Flavonoid (flavonols danflav nols) umumnya dikenal dengan aktivitas antioksidan in vitro. Konsumen dan produsen makanan menjadi tertarik pada flavonoid untuk sifat obat mungkin, terutama peran mereka diduga dalam pencegahan kanker dan penyakit kardiovaskular. Meskipun bukti fisiologis tidak belum didirikan, efek menguntungkan dari buah-buahan, sayuran, dan teh atau bahkan merah anggur kadang-kadang telah dituduhkan flavonoid senyawa daripada mikronutrien dikenal, seperti vitamin dan mineral.
            Flavonoid adalah komposisi dalam makanan yang merupakan antioksidan penangkal radikal bebas. Anda bisa menemukan flavonoid di dalam buah-buahan atau sayuran tertentu. Fungsinya adalah melindungi dinding pembuluh darah, mengurangi risiko alergi, menjaga kesehatan otak, hingga mencegah beberapa penyakit kanker. Berikut ini makanan  yang  dapat kita konsumsi untuk mendapatkan khasiat flavonoid.






1. Blueberry
Blueberry mengandung antioksidan tinggi yang melindungi dinding pembuluh darah dan melindungi otak dari Alzheimer. Di dalam blueberry juga ada senyawa bernama D-mannose yang membantu Anda mencegah infeksi saluran kencing. Selain itu, blueberry ampuh mengurangi inflamasi pada perut dan sistem pencernaan.
2. Teh hijau
Makanan lain yang mengandung flavonoid adalah teh hijau. Senyawa utama di dalam teh hijau khususnya adalah polyphenol yang merupakan antioksidan pencegah inflamasi dan kanker. Sudah banyak pula penelitian yang membahas kandungan dalam teh hijau (kafein, theanine, dan catechin) yang membantu peningkatkan sistem metabolisme tubuh.
3. Cokelat
Cokelat kaya akan antioksidan yang menyehatkan sistem kardiovaskular. Misalnya menurunkan tekanan darah tinggi, melancarkan sistem peredaran darah, dan membuat trombosit bekerja dengan lebih baik. Namun hanya cokelat hitam yang memiliki khasiat flavonoid secara maksimal.
4. Bilberry
Salah satu herbal alami yang juga kaya akan flavonoid adalah bilberry (bagian dari vitamin C kompleks). Penelitian pernah membuktikan bahwa jenis flavonoid tersebut membantu memperkuat dinding pembuluh darah dan mencegah kelainan mata. Selain bilberry, cherry dan blackberry juga termasuk sumber flavonoid yang baik.
5. Sayuran
Terakhir, ada sayuran yang disebutkan sebagai salah satu makanan yang kaya akan flavonoid. Misalnya brokoli, kale, bawang bombai, paprika, dan bayam. Namun sayang jamur bukan termasuk sayuran yang mengandung flavonoid. Meskipun ada banyak khasiat lain dari jamur itu sendiri. Kita juga bisa menikmati sayuran dan buah mentah setiap hari untuk asupan flavonoid bagi tubuh. Namun jika menderita masalah kesehatan tertentu dan alergi terhadap beberapa makanan, Anda bisa mengonsumsi suplemen flavonoid.







F. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder
Prinsip dari pemisahan (isolasi) adalah adanya perbedaan sifat fisik dan kimia dari senyawa yaitu kecendrungan dari molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian), kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk labus (adsorpsi, penserapan) (Harborne, 1987).
Salah satu cara pemisahan adalah kromatografi cair vakum, kromatografi cair vakum adalah kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi. Corong G-3 diisi adsorben sampai setinggi 2,5 cm, kemudian diketuk-ketuk dengan batang pengaduk bersalut dilarutkan dalam pelarut organik yang cocok, kemudian ke dalam larutan ekstrak tersebut ditambahkan adsorben dengan bobot sama dengan bobot ekstrak. Campuran ini digenis sampai homogen, dikeringkan dan dimasukkan ke dalam corong G-3 kemudian diratakan. Permukaan lapisan adsorben ditutup dengan kertas saring. Elusi diawali dengan pelarut non polar dilarutkan dengan kombinasi pelarut dengan polaritas meningkat. Jumlah pelarut yang digunakan setiap kali elusi untuk bobot ekstrak sampai lima gram diperlukan 25 ml pelarut, untuk 10-30 gram ekstrak diperlukan 50 ml pelarut. Dalam hal ini, diameter corong dipilih sedemikian rupa sehingga lapisan ekstrak dipermukaan kolom setipis mungkin dan rata. Masing-masing pelarut dituangkan ke permukaan kolom kemudian dihisapkan pompa vakum. Masing-masing ekstrak ditampung dalam wadah terpisah sehingga menghasilkan sejumlah fraksi (Soediro, dkk.,1986).
F. Isolasi dan Identifikasi Flavonoid
1. Isolasi Flavonoid
Isolasi flavonoid umumnya dilakukan dengan metode ekstraksi, yakni dengan cara maserasi atau sokletasi menggunakan pelarut yang dapatmelarutkan flavonoid. Flavonoid pada umumnya larut dalam pelarutpolar, kecuali flavonoid bebas seperti isoflavon, flavon, flavanon,dan flavonol termetoksilasi lebih mudah larut dalam pelarut semipolar. Oleh karena itu pada proses ekstraksinya, untuk tujuanskrining maupun isolasi, umumnya menggunakan pelarut methanol atauetanol. Hal ini disebabkan karena pelarut ini bersifat melarutkan senyawa–senyawa mulai dari yang kurang polar sampai dengan polar. Ekstrak methanol atau etanol yang kental, selanjutnya dipisahkankandungan senyawanya dengan tekhnik fraksinasi, yang biasanyaberdasarkan kenaikan polaritas pelarut (Monache, 1996).
            Senyawa flavonoid diisolasi dengan tekhnik maserasi,mempergunakan poelarut methanol teknis. Ekstraksi methanol kental kemudian dilarutkan dalam air. Ekstrak methanol–air kemudian difraksinasi dengan n-heksan dan etil asetat. Masing–masing fraksiyang diperoleh diuapkan, kemudian diuji flavonoid. Untuk mendeteksiadanya flavonoid dalam tiap fraksi, dilakukan dengan melarutkansejumlah kecil ekstrak kental setiap fraksi kedalam etanol.Selanjutnya ditambahkan pereaksi flavonoid seperti : natriumhidroksida, asam sulfat pekat, bubuk magnesium–asam klorida pekat,atau natrium amalgam–asam klorida pekat. Uji positif flavonoidditandai dengan berbagai perubahan warna yang khas setiap jenisflavonoid (Geissman, 1962).
Cara lain yang dapat dipakai untuk pemisahan adalah ekstraksi cair-cair, kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas. Isolasi dan pemurnian dapat dilakukan dengan kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas preparatif dengan pengembangan yang dapat memisahkan komponen paling baik (Harborne, 1987). Flavonoid (terutama glikosida) mudah mengalami degradasi enzimatik ketika dikoleksi dalam bentuk segar. Oleh karena itu disarankan koleksi yang dikeringkan atau dibekukan. Ekstraksi menggunakan solven yang sesuai dengan tipe flavonoid yg dikehendaki. Polaritas menjadi pertimbangan utama. Flavonoid kurang polar (seperti isoflavones, flavanones, flavones termetilasi, dan flavonol) terekstraksi dengan chloroform, dichloromethane, diethyl ether, atau ethyl acetate, sedangkan flavonoid glycosides dan aglikon yang lebih polar terekstraksi dengan alcohols atau campuran alcohol air. Glikosida meningkatkan kelarutan ke air dan alkohol-air. Flavonoid dapat dideteksi dengan berbagai pereaksi, antara lain:
a.       Sitroborat
b.      AlCl3
c.       NH3

Sebelum melakukan suatu isolasi senyawa, maka yang dilakukan adalah ekstraksi terlebih dahulu.


a.  Ekstraksi
Ekstraksi artinya mengambil atau menarik suatu senyawa yang terdapat dalam suatu bahan dengan pelarut yang sesuai. Proses yang terjadi dalam ekstraksi adalah terlarutnya senyawa yang dapat larut dari sel melalui difusi, tergantung dari letak senyawa dalam sel dan juga permeabilitas dinding sel dari bahan yang akan di ekstraksi.
Ekstraksi adalah suatu proses atau metode pemisahan dua atau lebih komponendengan menambahkan suatu pelarut yang hanya dapat melarutkan salahsatu komponennya saja. Dalam prosedur ekstraksi, larutan berair biasanya dikocok dengan pelarutorganik yang tak dapat larut dalam sebuah corong pemisah. Zat – zatyang dapt larut akan terdistribusi diantara lapisan air dan lapisanorganik sesuai dengan (perbedaan) kelarutannya. Padaekstraksi senyawa – senyawa organik dari larutan berair, selain airatau eter, biasanya digunakan pula etil asetat, benzena, kloroform dan sebagainya. Ekstraksi lebih efisien bila dilakukan berulang kali dengan jumlah pelarut yanglebih kecil dari pada bila jumlah pelarutnya banyak tapi ekstraknyahanya sekali (Markham, 1988).
            Metode ekstraksi terdiri atas dua jenis yakni ekstraksi panas dan ekstraksi dingin. Ekstraksi panas menggunakan cara refluks dan destilasi uap sedangkan ekstraksi secara dingin menggunakan cara maserasi,perkolasi dan soxhletasi.
1) Ekstraksi Secara Panas
(a) Ekstraksi Secara Refluks.
Ekstraksi secara refluks adalah cara berkesinambungan dimana cairan penyari secara kontinyu menyari zat aktif dalam sampel.
(b)Ekstraksi Secara Destilasi Uap
            Ekstraksi secara destilasi uap adalah cara yang digunakan untuk menyaring saampel yang mangandung minyak yang mudah menguap ataumengandung komponen kimia yang mempunyai titik didih tinggi padatekanan udara normal. Destilasi merupakan metode ekstraksi yang memanfaatkan perbedaan titik didih dari senyawa. Biasa digunakan untuk mengisolasi minyak atsiri.

2) Ekstraksi Secara Dingin
(a) Ekstraksi Secara Maserasi
            Secara harfiah berarti merendam. Ekstraksi secara maserasi merupakan cara penyarian yang palingsederhana yang dilakukan dengan cara merendam serbuk sampel dalamcairan penyari. Metode ini merupakan metode yang paling sederhana. Tidak ada batas pelarut dalam metode ini. Jika menggunakan metode ini, simplisia dibasahkan terlebih dahulu, jika tidak di khawatirkan akan ada simplisia yang tidak teraliri pelarut. Proses maserasi sendiri dilakukan secara berulang dengan memisahkan cairan perendam dengan cara penyaringan, dekantir atau di peras, selanjutnya ditambahkan lagi penyari segar kedalam ampas hingga warna rendaman sama dengan warna pelarut.
(b) Ekstraksi Secara Perkolasi
            Perkolasi adalah suatu cara penarikan dengan memakai alat yang yang disebut perkolator, dimana simplisia terendam dalam cairan penyari sehingga zat-zatnya terlarut dan larutan tersebut akan menetes secara beraturan keluar sampai memenuhi syarat-syarat yang telah ditetapkan. Ekstraksi secara perkolasi merupakan cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk sampel yang telah dibasahi.
(c) Ekstraksi Secara Soxhletasi
Merupakan metode ekstraksi yang memanfaatkan pemanasan untuk destilasi pelurut sehingga terjadi sirkulasi pelarut melalui serbuk simplisia. Metode ini efisiensi dalam pemanfaatan pelarut tetapi berisiko pembentukan artefak akibat penggunaaan panas. Ekstraksi secara soxhletasi merupakan cara penyarian sampel secaraberkesinambungan, cairan penyari dipanaskan sehingga menguap, uapcairan penyari terkondensasi menjadi molekul-molekul cairan oleh pendingin balik dan turun menyari sampel di dalam klonson dan selanjutnya masuk kembali ke dalam labu alas bulat setelah melewati pipa siphon.




b.  Kromatografi
Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase yaitu fasa tetap (stationary) dan fasa gerak (mobile), pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua fasa tersebut. Kromatografi secara garis besar dapat dibedakan menjadi kromatografi kolom dankromatografi planar. Kromatografi kolom terdiri atas kromatografi gas dan kromatografi cair, sedangkan kromatografi planar terdiri ataskromatografi lapis tipis dan kromatografi kertas (Anwar, 1994).
            Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa tetap, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa tetap berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan, jika zat cair dikenal sebagai kromatografi partisi. Karena fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas maka semua ada empat macam sistem kromatografi yaitu kromatografi serapan yang terdiri dari kromatografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion, kromatografi padat, kromatografi partisi dan kromatografi gas-cair serta kromatografi kolom kapiler .
Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda (Harborne, 1987).
Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut. Kecepatan senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung pada kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut (Harborne, 1987).
Kemampuan senyawa melekat pada fase diam, misalnya gel silika tergantung pada besar atraksi antara senyawa dengan gel silika. Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada gel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya karena senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan (Harborne, 1987). Penyerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan gel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada gel silika -untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti- dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan (Harborne, 1987). Dalam hal ini, senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan menjerap lebih kuat daripada yang tergantung hanya pada interaksi van der Waals, dan karenanya bergerak lebih jauh pada lempengan.
Jika komponen-komponen dalam campuran dapat membentuk ikatan-ikatan hydrogen, terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan gel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting dimana hal ini akan mempengaruhi mudahnya proses senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika. Ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik ketika membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu dengan baik, termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut. Ini merupakan tingkatan uji coba, jika satu pelarut atau campuran pelarut tidak berkerja dengan baik, maka dapat mencoba dengan pelarut lainnya (Harborne, 1987).
Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka dapat diekstraksi dengan etanol 70 % dan tetap ada dalam lapisan air setelah ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambah basa atau amonia, jadi mereka mudah dideteksipada kromatogram atau dalam larutan (Harborne, 1987 : 70).
1.  Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis adalah suatu metode pemisahan yang menggunakan plat atau lempeng kaca yang sudah dilapiskan adsorben yang bertindak sebagaifasa diam. Fase bergerak ke atas sepanjang fase diam danterbentuklah kromatogram. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahandan sensitif (Khopkar, 1990). Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fitokimia. Lapisan yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal), kemudian pelat dimasukkan di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) dan selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (Stahl, 1985).
Pada prinsipnya KLT dilakukan berdasarkan pada penggunaan fasa diam untuk menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Fasa diam yang biasadigunakan dalam KLT adalah serbuk silika gel, alumina, tanah diatomedan selulosa (Harborne, 1987). Adapun carakerja dari KLT yakni larutan cuplikan sekitar 1% diteteskan denganpipet mikro pada jarak 1-2 cm dari batas plat. Setelah eluen ataupelarut dari noda cuplikan menguap, plat siap untuk dikembangkandengan fasa gerak (eluen) yang sesuai hingga jarak eluen dari batasplat mencapai 10-15 cm. Mengeringkan sisa eluen dalam plat dengandidiamkan pada suhu kamar. Noda pada plat dapat diamati langsung dengan menggunakan lampu UV atau dengan menggunakan pereaksi semprot penampak warna. Setelah noda dikembangkan dan divisualisasikan,identitas noda dinyatakan dengan harga Rf (retardation factor)(Anwar, 1994).
Tujuan mendapatkan identitas noda dengan harga Rf untuk mencari pelarut untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh darikromatografi kolom, menyigi arah atau perkembangan reaksi seperti hidrolisis atau metilasi, identifikasi flavonoid secarako-kromatografi dan isolasi flavonoid murni skala kecil (Markham,1988).
KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Roy, et. all, 1991). Beberapa keuntungan dari kromatografi planar ini menurut Ibnu Gholib Gandjar dan Abdul Rohman (2007) adalah :
• Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.
• Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorisensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
• Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.
• Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Harborne, 1987).
Keuntungan kromatografi lapis tipis adalah dapat memisahkan senyawa yang sangat berbeda seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintesis, kompleks organik dan anorganik serta ion anorganik dalam waktu singkat menggunakan alat yang tidak terlalu mahal. Metode ini kepekaannya cukup tinggi dengan jumlah cuplikan beberapa mikrogram. Kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah dapat digunakan pereaksi asam sulfat pekat yang bersifat korosif, kelemahannya adalah harga RF yang tidak tetap (Gritten, et. al., 1991).
a)  KLT Preparatif
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan.

b)  KLT 2 Dimensi
KLT 2 arah atau 2 dimensi bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda .
Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satu sistem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90° dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi .


Deteksi dengan KLT dapat dilakukan dengan cara:
1.      Sinar tampak
2.      Sinar UV
3.      Pereaksi warna

2.  Kromatografi Kolom
            Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan dan pemurnian senyawa dalam skalapreparative. Kromatografi kolom dapat dilakukan pada tekanan atmosferatau dengan tekanan lebih besar dengan menggunakan bantuan tekananluar (Khopkar, 1990).  Kromatografikolom prinsipnya mudah memilih ukuran, kemasan (packing), dan isikolom sesuai jenis serta jumlah cuplikan yang akan dipisahkan. Kolomyang digunakan dan kromatografi ini dapat berupa gelas, plastik ataunilom. Ukuran kolom yang lazim digunakan mempunyai diameter 2 cm danpanjang 45 cm. Untuk memilih kemasan (Packing) yang akan digunakandalam kolom biasanya menggunakan selulosa, silika gel, alumina, arang(charcoal) (Anwar, 1994).
Adapun cara kerja dari kromatografi kolom yakni langkah pertama mengemas kolom(packing) dilakukan dengan hati-hati agar dihasilkan kolom kemas yangserba sama. Selanjutnya kemasan kolom dijadikan bubur dalam gelaspiala memakai pelarut yang sama, lalu dituangkan hati-hati ke dalamkolom. Kemasan dibiarkan turun dan pelarut yang berlebihandikeluarkan melalui keran. Selanjutnya langkah kedua menempatkanlarutan cuplikan pada (bagian atas) kolom sehingga terbentuk pitayang siap untuk dielusi lebih lanjut. Cuplikan harus dilarutkan dalampelarut yang volumenya sedikit. Pelarut yang dipakai harus samadengan pelarut untuk mengelusi (Markham, 1988).
 3. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
            High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978).
Informasi seperti kelarutan, gugus fungsi yang ada, besarnya berat molekul (BM) dapat diperoleh dari pembuat informasi, pemberi sampel, atau data spektroskopik seperti Nucleic Magnetic Resonance Spectrosphotometer (NMR), Infrared spectrophotometer, ultra violet spectrumeter, dan mass Spectrophotometer. Semua data-data ini dapat digunakan sebagai petunjuk bagi analis memilih tipe HPLC yang tepat untuk digunakan (Johnson dan Stevenson, 1978)
            Berdasarkan Hukum Dasar "like dissolves like" maka sangat mudah untuk memutuskan tipe KCKT yang akan dipilih. Seleksi tipe KCKT, dengan cepat kita dapat melihat bahwa Berat Molekul (BM) lebih besar dari 2000, maka kita dapat menggunakan kromatografi eksklusi. Fasa geraknya adalah air jika sampelnya larut dalam air; bila dapat larut dalam pelarut organik maka digunakan pelarut- pelarut organik sebagai rasa gerak. Fasa diamnya adalah Sephadex atau Bondagel Seri E untuk rasa gerak air dan Styragel atau MicroPak TSK gel untuk rasa gerak organik. Bila BM lebih rendah dari 2000, pertama yang harus ditentukan adalah apakah sampel dapat larut dalam air. Bila sampel dapat larut dalam air, maka kromatografi partisi rasa terbalik atau kromatografi penukar ion dapat digunakan. Bila kelarutan dipengaruhi oleh penambahan asam atau basa atau bila pH larutan bervariasi lebih dari 2 (dua) satuan pH dari pH 7, maka kromatografi penukar ion adalah pilihan utama. Bila kelambatan tidak dipengaruhi oleh asam dan basa dan larutan sampel adalah netral, maka kromatografi partisi rasa terbalik adalah pilihan terbaik. Tipe Eksklusi menggunakan ukuran poros yang kecil dan rasa air dapat juga dicoba.
c.   Metode Spektroskopi
            Spektroskopi merupakan suatu metode untuk penentuan rumus struktur dari suatu senyawa. Menurut Anwar (1994) bahwa spektroskopi bila dibandingkandengan metode kimia konvensional (metode basah), spektroskopi memiliki beberapa keuntungan, diantaranya : Jumlah zat yang diperlukan untuk analisis relatif kecil dan zat tersebut sering kali dapat diperoleh kembali dan waktu pengerjaannya relatif cepat.
Dasar metode spektroskopi adalah molekul pada suatu energi level tertentu,misalnya E1,disinari dengan sinar tertentu. Sinar ini akan melewati molekul itudan seterusnya melewati suatu detektor. Selama molekul itu tidakmenyerap sinar itu maka sinar yang terdeteksi akan sama intensitasnyadengan sinar yang berasal dari sumber. Pada frekuensi yangmemungkinkan terjadinya pemindahan energi level molekul misalnya dariE1 keE2,maka sinar akan diserap oleh frekuensi yang memungkinkan terjadinyapemindahan energi level molekul misalnya dari E1ke E2,maka sinar akan diserap oleh molekul dan tidak akan tampak dalamdetektor (Siregar, 1988).
1). Spektrofotometri Ultra Lembayung (UV)
            Spektrofotometri UV adalah suatu alat yang menggambarkan antara panjang gelombang atau frekuensi lawan intensitas serapan (absorbansi). Spektrosfotometri UV ini menghasilkan radiasi (cahaya) dengan panjang gelombang 200– 400 nm (Anwar, 1994). Pada umumnya spektrofotometri UV umumnyahanya menunjukkan jumlah peak (puncak ) yang kecil jumlahnya.Puncak-puncak dilaporkan sebagai panjang gelombang.
            Spektrofotometri ini biasanya juga digunakan untuk mendeteksi konjugasi. Molekul-molekul yang tidak mempunyai ikatan rangkap atau hanya mempunyai satu ikatan tidak menyerap sinar 200-800 nm. Lainhalnya dengan senyawa-senyawa yang mempunyai sistem konyugasi yang dapat menyerap sinar pada daerah ini, semakin panjang sistem konyugasinya maka makin besar panjang gelombang absorpsi (Siregar,1988).
Untuk menganalisis struktur dari senyawa-senyawa dari metabolitsekunder seperti senyawa flavonoid, spektroskopi UV merupakan carayang terbaik untuk mengkarakterisasi jenis-jenis senyawa flavonoiddan menentukan pola oksigenasi. Kedudukan gugus hidroksil fenol bebasyang terdapat pada inti flavonoid dapat ditentukan juga denganmenambahkan pereaksi geser (Markham, 1988).
Spektrum Flavonoid Umum
            Spektroskopi serapan lembayung dan serapan sinar tampak digunakan untuk membantu mengidentifikasi jenis flavonoid dan menentukan pola oksigenasi. Disamping itu, kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dapat ditentukan dengan menambahkan pereaksi (pereaksi geser) ke dalam larutancuplikan dan mengamati pergeseran puncak serapan yang terjadi. Cara ini berguna untuk menentukan kedudukan gula atau metil yang terikat pada salah satu gugushidroksil fenol (Markham, 1988 : 38).Spektrum flavonoid (gambar 2) biasanya ditentukan dalam larutan denganpelarut metanol atau etanol. Spektrum khas terdiri atas dua maksimal pada rentang240-285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan kekuatannisbi maksimal tersebut memberikan informasi yang berharga mengenai sifatflavonoid dan pola oksigenasinya.
            Spektrum khas jenis flavonoid utama dengan pola oksigenasi yang setara (5,7,4) adalah kekuatan nisbi yang rendah pada pita Idalam dihidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon. Ciri nisbi ini tidak berubah,bahkan bila pola oksigenasi berubah, sekalipun rentang maksimal serapan pada jenis flavonoid (tabel 2) yang berlainan tumpang tindih sebagai keseragaman polaoksigenasi. Keseragaman dalam rentang maksimal ini akan bergantung pada polahidroksilasi dan pada derajat substitusi gugus hidroksil (Markham, 1988 : 39).

 Cara Isolasi dan Identifikasi Flavonoid Secara Umum
1.  Isolasi Dengan metanol
            Terhadap bahan yang telah dihaluskan, ekstraksi dilakukan dalam dua tahap. Pertama dengan metanol:air (9:1) dilanjutkan dengan metanol:air (1:1) lalu dibiarkan 6-12 jam. Penyaringan dengan corong buchner, lalu kedua ekstrak disatukan dan diuapkan hingga 1/3 volume mula-muIa, atau sampai semua metanol menguap dengan ekstraksi menggunakan pelarut heksan atau kloroform (daIam corong pisah) dapat dibebaskan dari senyawa yang kepolarannya rendah, seperti lemak, terpen, klorofil, santifil dan lain-lain

2.  Isolasi Dengan Charaux Paris
            Serbuk tanaman diekstraksi dengan metanol,lalu diuapkan sampai kental dan ekstrak kental ditambah air panas dalam volume yang sama, Ekstrak air encer lalu ditambah eter, lakukan ekstraksi kocok, pisahkan fase eter lalu uapkan sampai kering yang kemungkinan didapat bentuk bebas. Fase air dari hasil pemisahan ditambah lagi pelarut etil. asetat diuapkan sampai kering yang kemungkinan didapat Flavonoid O Glikosida. Fase air ditambah lagi pelarut n - butanol, setelah dilakukan ekstraksi, lakukan pemisahan dari kedua fase tersebut. Fase n-butanol diuapkan maka akan didapatkan ekstrak n - butanol yang kering, mengandung flavonoid dalam bentuk C-glikosida dan leukoantosianin. Dari ketiga fase yang didapat itu langsung dilakukan pemisahan dari komponen yang ada dalam setiap fasenya dengan mempergunakan kromatografi koLom. Metode ini sangat baik dipakai dalam mengisolasi flavonoid dalam tanaman karena dapat dilakukan pemisahan flavonoid berdasarkan sifat kepolarannya.

3.  Isolasi dengan beberapa pelarut.
            Serbuk kering diekstraksi dengan kloroform dan etanol, kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan dibawah tekanan rendah. Ekstrak etanol pekat dilarutkan dalam air lalu diekstraksi gojog dengan dietil eter dan n-butanol, sehingga dengan demikian didapat tiga fraksi yaitu fraksi kloroform, butanol dan dietil eter.
4.  Identifikasi Dengan Reaksi warna
                  a. Uji WILSTATER
Uji ini untuk mengetahui senyawa yang mempunyai inti δ benzopiron. Warna-warna yang dihasilkan dengan reaksi Wilstater adalah sebagai berikut:
- Jingga Daerah untuk golongan flavon.
- Merah krimson untuk golongan fLavonol.
- Merah tua untuk golongan flavonon.
b. Uji BATE SMITH MATECALVE
                    Reaksi warna ini digunakan untuk menuniukkan adanya senyawa   leukoantosianin, reaksi positif jika terjadi warna merah yang intensif atau  warna ungu.

5. Identifikasi flavonoid
            Sebagian besar senyawa flavonoid alam ditemukan dalam bentuk glikosidanya, dimana unit flavonoid terikat pada suatu gula. Glikosida adalah kombinasi antara gula dan suatu alcohol yang saling berikatan melalui ikatan glikosida. Pada prinsipnya, ikatan glikosida terbentuk apabila gugus hidroksil dari alcohol beradisi kepada gugus karbonil dari gula, sama seperti adisi alcohol kepada aldehid yang dikatalis oleh asam menghasilkan suatu asetal.
            Pada hidrolisis oleh asam, suatu glikosida terurai kembali atas komponen-komponennya menghasilkan gula dan alcohol yang sebanding dan alcohol yang dihasilkan ini disebut aglokin. Residu gula dari glikosida flavonoid alam adalah glukosa tersebut masinbg-masing disebut glukosida, ramnosida, galaktosida dan gentiobiosida. Flavonoida dapat ditemukan sebagai mono-, di- atau triglikosida dimana satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan sedikit larut dalam pelarut organic seperti eter, benzene, kloroform dan aseton.
            Flavonoid merupakan metabolit sekunder dalam tumbuhan yang mempunyai variasi struktur yang beraneka ragam, namun saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama. Jalur biosintesis flavonoid dimulai dari pertemuan alur asetat malonat dan alur sikimat membentuk khalkon, dari bentuk khalkon ini diturunkan menjadi bentuk lanjut menjadi berbagai bentuk lewat alur antar ubah posisi, dehidrogenasi, denetilasi dan lain-lain. Kenudian daripada itu menghasilkan bentuk sekunder dihidrokalkon, flavon, auron, isoflavon (penurunan selanjutnya membentuk peterokarpon dan rotenoid) dan dehidroflavonol (penurunan selanjutnya antosianidin, flavonol, epikatekin ) .
            Dari bentuk-bentuk sekunder tersebut akan terjadi modifikasi lebih lanjut pada berbagai tahap dan menghasilkan penambahan / pengurangan hidroksilasi, metilenasi, ortodihidroksil, metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoid, dimerisasi, pembentukan bisulfat, dan yang terpenting glikolisasi gugus hidroksil

G. Manfaat dan Kegunaan Flavonoid
            Flavonoid merupakan sejenis senyawa fenol terbesar yang ada, senyawa ini terdiri dari lebih dari 15 atom karbon yang sebagian besar bisa ditemukan dalam kandungan tumbuhan.Flavonoid juga dikenal sebagai vitamin P dan citrin, dan merupakan pigmen yang diproduksi oleh sejumlah tanaman sebagai warna pada bunga yang dihasilkan.Bagian tanaman yang bertugas untuk memproduksi flavonoid adalah bagian akar yang dibantu oleh rhizobia, bakteri tanah yang bertugas untuk menjaga dan memperbaiki kandungan nitrogen dalam tanah.
Pada tumbuhan tinggi, flavonoid terdapat baik dalam bagian vegetatif maupun dalam bunga. Sebagai pigmen bunga flavonoid berperan jelas dalam menarik burung
dan serangga penyerbuk bunga. Beberapa flavonoid tak berwarna, tetapi flavonoid
yang menyerap sinar UV barangkali penting juga dalam mengarahkan serangga.
Beberapa kemungkinan fungsi flavonoid untuk tumbuhan yang mengandungnya
adalah pengaturan tumbuh, pengaturan fotosintesis, kerja antimikroba dan antivirus,
dan kerja terhadap serangga (Robinson, 1995).         
            Tidak ada benda yang begitu menyolok seperti flavonoida yang memberikan kontribusi keindahan dan kesemarakan pada bunga dan buah-buahan di alam. Flavin memberikan warna kuning atau jingga, antodianin memberikan warna merah, ungu atau biru, yaitu semua warna yang terdapat pada pelangi kecuali warna hijau. Secara biologis flavonoida memainkan peranan penting dalam kaitan penyerbukan tanaman oleh serangga. Sejumlah flavonoida mempunyai rasa pahit sehingga dapat bersifat menolak sejenis ulat tertentu.
            Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok fenol yang terbesar yang ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu dan biru dan sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoid merupakan pigmen tumbuhan dengan warna kuning, kuning jeruk, dan merah dapat ditemukan pada buah, sayuran, kacang, biji, batang, bunga, herba, rempah-rempah, serta produk pangan dan obat dari tumbuhan seperti minyak zaitun, teh, cokelat, anggur merah, dan obat herbal.
            Senyawa ini berperan penting dalam menentukan warna, rasa, bau, serta kualitas nutrisi makanan. Tumbuhan umumnya hanya menghasilkan senyawa flavonoid tertentu. Keberadaan flavonoid pada tingkat spesies, genus atau familia menunjukkan proses evolusi yang terjadi sepanjang sejarah hidupnya. Bagi tumbuhan, senyawa flavonoid berperan dalam pertahanan diri terhadap hama, penyakit, herbivori, kompetisi, interaksi dengan mikrobia, dormansi biji, pelindung terhadap radiasi sinar UV, molekul sinyal pada berbagai jalur transduksi, serta molekul sinyal pada polinasi dan fertilitas jantan. Senyawa flavonoid untuk obat mula-mula diperkenalkan oleh seorang Amerika bernama Gyorgy (1936). Secara tidak sengaja Gyorgy memberikan ekstrak vitamin C (asam askorbat) kepada seorang dokter untuk mengobati penderita pendarahan kapiler subkutaneus dan ternyata dapat disembuhkan. Mc.Clure (1986) menemukan pula oleh bahwa senyawa flavonoid yang diekstrak dari Capsicum anunuum serta Citrus limon juga dapat menyembuhkan pendarahan kapiler subkutan. Mekanisme aktivitas senyawa tersebut dapat dipandang sebagai fungsi „alat komunikasi (molecular messenger} dalam proses interaksi antar sel, yang selanjutnya dapat berpengaruh terhadap proses metabolisme sel atau mahluk hidup yang bersangkutan, baik bersifat negatif (menghambat) maupun bersifat positif (menstimulasi).

1. Flavonoid sebagai Antioksidan
                Berbagai sayuran dan buah-buahan yang dapat dimakan mengandung sejumlah flavonoid. Konsentrasi yang lebih tinggi berada pada daun dan kulit kupasannya dibandingkan dengan jaringan yang lebih dalam. Stavric dan Matula(1992) melaporkan bahwa di negara-negara Barat, konsumsi komponen flavonoid bervariasi dari 50 mg sampai 1 g per hari dengan 2 jenis flavonoid terbesar berupa quersetin dan kaempferol. Sebagai antioksidan, flavonoid dapat menghambat penggumpalan keping-keping sel darah, merangsang produksi nitrit oksida yang dapat melebarkan (relaksasi) pembuluh darah, dan juga menghambat pertumbuhan sel-sel kanker.
            Flavonoid juga memiliki beberapa sifat seperti hepatoprotektif, antitrombotik, antiinflamasi, dan antivirus (Stavric dan Matula, 1992). Sifat antiradikal flavonoid terutama terhadap radikal hidroksil, anionsuperoksida, radikal peroksil, dan alkoksil (Huguet, et al., 1990; Sichel,et al.,1991). Senyawa flavonoid ini memiliki afinitas yang sangat kuat terhadap ion Fe (Fe diketahui dapat  mengkatalisis beberapa proses yang  menyebabkan terbentuknya radikal bebas). Aktivitas antiperoksidatif flavonoid ditunjukkan melalui potensinya sebagai pengkelat Fe (Afanasav,et al., 1989 ; Morel,et al.,1993).
            Manfaat utama flavonoid dalam tubuh manusia adalah sebagai antioksidan yang bisa menghambat proses penuaan dan mencegah berkembangnya sel kanker. Salah satu jenis tanaman yang dipercaya dan terbukti memiliki kandungan flavonoid yang cukup tinggi adalah tanaman cokelat. (nn).         
            Flavonoid dikatakan antioksidan karena dapat menangkap radikal bebas dengan membebaskan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya. Aksi radikal memberikan efek timbulnya berbagai penyakit yang berbahaya bagi tubuh. Tubuh manusia tidak mempunyai sistem pertahanan antioksidatif yang lebih sehingga apabila terkena radikal bebas yang tinggi dan berlebih, tubuh tidak dapat menanggulanginya. Saat itulah tubuh manusia membutuhkan antioksidan dari luar (eksogen) yang dapat dilakukan dengan asupan senyawa yang memiliki kandungan antioksidan yang tinggi melalui suplemen, makanan, dan minuman yang dikonsumsi.
            Namun, globalisasi yang merupakan zaman sintetik membuat manusia khawatir terhadap antioksidan buatan yang pada umumnya memberikan efek samping yang tidak ringan. Globalisasi membuat masyarakat menjadi semakin pandai dan kritis termasuk dalam memilih produk makanan atau minuman yang akan dikonsumsi. Berkembangnya berbagai jenis penyakit terutama yang diakibatkan oleh pola konsumsi makanan yang salah, mendorong masyarakat kembali ke alam. Dengan kata lain, masyarakat kini mulai beralih pada upaya alami dengan mengonsumsi makanan atau minuman yang mengandung antioksidan alami yang tidak menimbulkan efek samping atau mungkin ada efek samping tetapi dengan efek yang relatif ringan. Jadi, antioksidan alami menjadi alternatif yang lebih diminati oleh masyarakat daripada antioksidan sintetik.
            Sebagai bahan alami, buah-buahan, sayuran, dan teh merupakan serat alami yang memiliki kandungan senyawa flavonoid dalam kadar yang tinggi. Seperti yang kita ketahui bahwa buah, sayuran, dan teh banyak mengandung vitamin dan mineral yang memang sangat berguna bagi kesehatan tubuh kita, misalnya kerena adanya kandungan vitamin E dan vitamin C yang memang telah dikenal sebagai antioksidan sehingga banyak dikonsumsi oleh masyarakat. Sejauh yang masyarakat umum ketahui, kandungan pada buah, sayuran, dan teh adalah kandungan vitamin dan mineralnya saja. Padahal di dalamnya juga terdapat kandungan flavonoid yang juga merupakan antioksidan. Bahkan flavonoid merupakan antioksidan yang jauh lebih baik dari pada antioksidan lainnya, seperti pada vitamin E dan vitamin C. Hal ini membuktikan bahwa flavonoid sebagai antioksidan memiliki potensi yang lebih tinggi sebagai obat antikanker dari pada vitamin dan mineral.
            Kandungan flavonoid ini memberi harapan sebagai pencegah antikanker. Penyakit yang sangat ditakuti saat ini adalah kanker. Kalau dahulu orang takut penyakit pes, kolera, cacar, TBC, tipus, dan jenis-jenis penyakit lain yang sekarang sudah tidak ditakuti lagi, sekarang orang selalu takut akan bahaya kanker yang sewaktu-waktu dapat timbul (Braam, 1980). Saat ini, cara pengobatan kanker yang biasa dilakukan oleh masyarakat pada umumnya adalah pembedahan, radioterapi, dan kemoterapi. Tujuan dari cara pengobatan tersebut adalah membunuh sel-sel kanker. Akan tetapi, perlu kita ketahui bahwa tidak sedikit dari cara-cara tersebut yang justru menimbulkan efek samping. Efek samping yang ditimbulkan tersebut akan menjadi beban baru bagi para penderita kanker. Oleh sebab itu, masyarakat mulai beralih pada pengobatan yang tidak menimbulkan efek samping atau mungkin ada efek samping tetapi dengan efek yang ringan
2. Penyakit Kanker
Kanker merupakan suatu penyakit yang disebabkan oleh pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal dan tidak terkendali. Drs. Wildan Yatim dalam bukunya Biologi (1996:100) menilai kanker sebagai berikut: ”Kanker mengandung sel-sel yang membelah terus secara cepat dan tak terkontrol. Sel-selnya memilki sifat seperti sel muda yang aktif bermitosis. Seperti sel-sel embrio, sel-sel kanker berinti besar, nukleus pun besar, dan dalam plasma terdapat banyak butiran dan membran tipis. Sel kanker bisa merusak sel-sel yang lain dan dapat pindah ke jaringan dan daerah lain”.
            Sudah jelas bahwa sel-sel kanker akan berkembang dengan cepat, tidak terkendali, dan akan terus membelah diri, selanjutnya menyusup ke jaringan sekitarnya (invasive) dan terus menyebar. Penyebarannya bisa melalui jaringan ikat, darah, dan yang lebih berbahaya lagi bahwa sel kanker dapat menyerang organ-organ penting dan saraf tulang belakang. Dalam keadaan normal, sel membelah diri apabila ada penggantian sel-sel yang telah mati dan rusak. Berbeda dengan sel kanker yang akan membelah terus meskipun tubuh tidak memerlukannya sehingga akan terjadi penumpukan sel baru. Sel baru ini lah yang disebut tumor ganas. Penumpukan sel tersebut mendesak dan merusak jaringan normal, sehingga mengganggu organ yang ditempatinya.
            Kanker dapat tumbuh di berbagai jaringan dalam berbagai organ di setiap tubuh mulai dari kaki sampai kepala. Bila kanker tumbuh pada bagian permukaan tubuh, maka akan dengan mudah diketahui oleh penderita. Akan tetapi, bila kanker tumbuh di dalam tubuh, maka penyakit yang dianggap misterius tersebut akan sulit diketahui sebab kadang-kadang tidak menunjukkan gejala apa pun, bahkan kanker tertentu baru akan dapat diketahui setelah kanker tersebut sudah ada pada stadium akhir atau lanjut, misalnya leukimia (kanker darah). Kalau pun timbul gejala, biasanya gejala tersebut terasa pada saat stadium lanjut sehingga terkadang sudah terlambat untuk diobati. Ini lah alasan utama mengapa kanker menjadi penyakit yang harus sangat diwaspadai oleh seluruh masyarakat.
            Selain lingkungan, makanan yang kita makan juga dapat menjadi faktor penyebab terjadinya kanker, terutama kanker pada saluran pencernaan sebab makanan yang dikonsumsi seseorang dapat mempengaruhi pengaktifan sel kanker pada saluran pencernaan. Contoh jenis makanan yang dapat menyebabkan kanker pada saluran pencernaan adalah makanan yang diasap dan diasamkan. Makanan tersebut dapat meningkatkan risiko terjadinya kanker lambung. Contoh lainnya adalah minuman yang mengandung alkohol yang menyebabkan kanker kerongkongan. Bahkan zat pewarna makanan pun dapat menjadi penyebab timbulnya kanker pada saluran pencernaan. Terdapat pula penyebab kanker pada saluran pencernaan, yaitu logam berat seperti mercury yang biasanya sering terdapat pada makanan laut yang tercemar, seperti kerang, ikan, dan sebagainya. Selain itu, perlu diperhatikan oleh masyarakat adalah bahwa berbagai makanan manis mengandung tepung yang diproses secara berlebihan juga merupakan faktor penyebab aktifnya sel kanker dalam tubuh.
a. Senyawa Flovonoid sebagai Antikanker
            Senyawa bioaktif flavonoid yang merupakan ekstrak metanol ini dikatakan sebagai antikanker karena dapat menghambat tumbuhnya sel-sel kanker itu sendiri. Sebagai antioksidan, senyawa flavonoid dapat mencegah reaksi bergabungnya molekul karsinogen dengan DNA sel sehingga mencegah kerusakan DNA sel. Di sini lah komponen bioaktif flavonoid dapat mencegah terjadinya proses awal pembentukan sel kanker. Bahkan flavonoid dapat merangsang proses perbaikan DNA sel yang telah termutasi sehingga sel menjadi normal kembali. Selain itu, dapat mencegah pembentukan pembuluh darah buatan sel kanker (proses angiogenesis) sehingga sel-sel kanker tidak dapat tumbuh menjadi besar karena saluran untuk pertumbuhannya terhambat.
            Makanan yang mengandung flavonoid, seperti stroberi hijau, kubis, apel, kacang-kacangan, dan bawang juga mengurangi risiko terjagkitnya penyakit kanker paru-paru. Hal ini menandakan bahwa untuk mencegah terjadinya kanker sangat lah mudah asalkan kita sendiri ada kemauan dalam menjaga kesehatan. Pepatah “lebih baik mencegah dari pada mengobati” pun menjadi amat tepat bila bicara mengenai kanker. Hal ini mengingat sulitnya pengobatan dan minimnya kesembuhan apabila seseorang sudah terjangkit kanker. Namun, manusia harus selektif dalam mengonsumsi makanan, minuman, sayuran, dan buah-buahan yang dianggap alami dan tidak memiliki efek samping. Hal ini tampaknya harus menjadi pertimbangan yang lebih jauh dari manusia mengingat zaman sekarang yang semakin maju dan mengakibatkan manusia selalu menginginkan yang instan, mudah, dan murah, misalnya penggunaan pestisida dalam perawatan buah dan sayuran untuk menghindari gangguan hama yang dapat membuat hasil buah atau sayuran menjadi rusak bahkan dapat menyebabkan gagal panen. Secara otomatis, pestisida yang disemprotkan pada buah atau sayuran tersebut akan menempel dan akan termakan oleh manusia yang mengonsumsinya. Padahal, jika kita lihat dari kandungannya, pestisida merupakan bahan kimia yang bersifat karsinogen yang dapat mengaktifkan sel-sel kanker pada tubuh manusia.
            Kandaswami dan Middleton (2004) mengatakan bahwa flavonoid dapat menghalangi reaksi oksidasi kolesterol jahat (LDL) yang menyebabkan darah mengental yang dapat mengakibatkan penyempitan pembuluh darah. Penyempitan pembuluh darah pada tubuh akan menyebabkan aliran darah tidak lancar dan jika dibiarkan dalam waktu yang terlalu lama, kemungkinan besar akan mengumpul bahkan menggumpal pada daerah tertentu. Penggumpalan darah ini dapat mengakibatkan sel-sel tersebut menjadi sel kanker yang dapat aktif apabila didukung oleh asupan bahan karsinogenik atau faktor luar lainnya yang dikonsumsi manusia.
            Flavonoid juga menghambat invasi tumor sehingga tumor tidak membesar dan tidak menjadi ganas yang menyebabkan kanker. Tumor yang tertanam dalam tubuh manusia apabila dibiarkan terlalu lama akan menjadi sel kanker yang ganas dan akan menggerogoti tubuh. Mengingat bahaya penyakit kanker bagi tubuh, manusia harus mengambil sikap dan antisipasi terhadap penyakit yang menyebabkan kematian tersebut, misalnya dengan mengonsumsi makanan yang mengandung flavonoid yang tinggi. Karena kandungannya yang banyak terdapat pada buah, sayur, dan teh, dapat dikatakan bahwa tidak sulit untuk melindungi diri dari penyakit berbahaya, seperti kanker. Perlindungan tersebut dikatakan cukup mudah sebab buah, sayur-sayuran, dan teh sangat mudah didapat.
Berbagai potensi senyawa isoflavon untuk keperluan kesehatan antara lain:
a.    Anti-inflamasi
Mekanisme anti-inflamasi terjadi melalui efek penghambatan jalur metabolisme asam arachidonat, pembentukan prostaglandin, pelepasan histamin, atau aktivitas „radical scavenging’ suatu molekul. Melalui mekanisme tersebut, sel lebih terlindung dari pengaruh negatif, sehingga dapat meningkatkan viabilitas sel. Senyawa flavonoid yang dapat berfungsi sebagai anti-inflamasi adalah toksifolin, biazilin, haematoksilin, gosipin, prosianidin, nepritin, dan lain-lain.
b.  Anti-tumor/Anti-kanker
            Senyawa isoflavon yang berpotensi sebagai antitumor/antikanker adalah genistein yang merupakan isoflavon aglikon (bebas). Genistein merupakan salah satu komponen yang banyak terdapat pada kedelai dan tempe. Penghambatan sel kanker oleh genistein, melalui mekanisme sebagai berikut :
(1) penghambatan pembelahan/proliferasi sel (baik sel normal, sel yang terinduksi oleh faktor pertumbuhan sitokinin, maupun sel kanker payudara yang terinduksi dengan nonil-fenol atau bi-fenol A) yang diakibatkan oleh penghambatan pembentukan membran sel, khususnya penghambatan pembentukan protein yang mengandung tirosin;
(2) penghambatan aktivitas enzim DNA isomerase II;
(3) penghambatan regulasi siklus sel;
(4) sifat antioksidan dan anti-angiogenik yang disebabkan oleh sifat reaktif terhadap senyawa radikal bebas;
 (5) sifat mutagenik pada gen endoglin (gen transforman faktor pertumbuhan betha atau TGFβ). Mekanisme tersebut dapat berlangsung apabila konsentrasi genestein lebih besar dari 5μM.
c.  Anti-virus
Mekanisme penghambatan senyawa flavonoida pada virus diduga terjadi melalui penghambatan sintesa asam nukleat (DNA atau RNA) dan pada translasi virion atau pembelahan dari poliprotein. Percobaan secara klinis menunjukkan bahwa senyawa flavonoida tersebut berpotensi untuk penyembuhan pada penyakit demam yang disebabkan oleh rhinovirus, yaitu dengan cara pemberian intravena dan juga terhadap penyakit hepatitis B. Berbagai percobaan lain untuk pengobatan penyakit liver masih terus berlangsung.
d. Anti-allergi
Aktivitas anti-allergi bekerja melalui mekanisme sebagai berikut :
 (1) penghambatan pembebasan histamin dari sel-sel mast, yaitu sel yang mengandung granula, histamin, serotonin, dan heparin;
(2) penghambatan pada enzim oxidative nukleosid-3,5 siklik monofast fosfodiesterase, fosfatase, alkalin, dan penyerapan Ca;
(3) berinteraksi dengan pembentukan fosfoprotein. Senyawa-senyawa flavonoid lainnya yang digunakan sebagai anti-allergi antara lain terbukronil, proksikromil, dan senyawa kromon.
e.  Penyakit kardiovaskuler
Berbagai pengaruh positif isoflavon terhadap sistem peredaran darah dan penyakit jantung banyak ditunjukkan oleh para peneliti pada aspek berlainan. Khususnya isoflavon pada tempe yang aktif sebagai antioksidan, yaitu 6,7,4- trihidroksi isoflavon (Faktor-II), terbukti berpotensi sebagai anti kotriksi pembuluh darah (konsentrasi 5μg/ml) dan juga berpotensi menghambat, pembentukan LDL (low density lipoprotein). Dengan demikian isoflavon dapat mengurangi terjadinya arterosclerosis pada pembuluh darah. Pengaruh isoflavon terhadap penurunan tekanan darah dan resiko CVD (cardio vascular deseases) banyak dihubungkan dengan sifat hipolipidemik dan hipokholesteremik senyawa isoflavon.
Berbagai bahan alam yang secara tradisional digunakan untuk penyakit kardio-vaskular, kebanyakan secara ilmiah telah dilaporkan memiliki khasiat sebagai antioksidan, namun pemanfaatan tumbuhan obat tersebut lebih banyak dilatar-belakangi oleh pengalaman empiris; masih sedikit sekali pembuktian secara ilmiah berdasarkan mekanisme kerjanya. Penelitian ini bertujuan mempelajari aktivitas antioksidan berbagai ekstrak bahan alam (daun salam, daun jati belanda, daun jambu biji, air cuka tahu dan jamur kuping hitam) pada berbagai tingkat konsentrasi sekaligus membandingkan potensi kelima ekstrak bahan alam, dan untuk mengkaji khasiat berbagai ekstrak bahan alam yang digunakan secara tradisional untuk pengobatan penyakit kardiovaskular melalui telaah modulasi mekanisme apoptosis dalam sistem nonmamalia dengan menggunakan sell ragi (Saccharomyces cerevisiae). Daun salam, daun jambu biji, daun Jati Belanda diekstraksi dengan metode refluks. Serbuk jamur kuping (60 mesh) diekstraksi dengan cara maserasi 24 jam menggunakan etanol 30% dengan perbandingan 1:6 (g:mL). Ekstrak cuka tahu dipersiapkan menggunakan etil asetat. Aktivitas antioksidan lima ekstrak bahan ditapis secara in vitro menggunakan sistem oksidasi asam linoleat dan mengukur produk oksidasinya secara spektrofotometri dengan metode asam tiobarbiturat (TBA assay) menggunakan tetrametoksipropana (TMP). Diperoleh bahwa semua ekstrak berpotensi antioksidan. Ekstrak etanol daun salam 1.000 ppm secara konsisten menunjukkan hambatan oksidasi hampir sama baiknya dengan aktivitas antioksi dan vitamin E pada konsentrasi 200 ppm; sedangkan pada 200 ppm juga mampu menghambat oksidasi asam linoleat sama baiknya dengan vitamin E konsentrasi yang sama. Ekstrak whey tahu memiliki aktivitas antioksidan paling rendah ( 82,02%),   walau masih lebih besar dari vitamin E.

f. Estrogen dan Osteoporosis
Pada wanita menjelang menopause, produksi estrogen menurun sehingga menimbulkan berbagai gangguan. Estrogen tidak saja berfungsi dalam sistem reproduksi, tetapi juga berfungsi untuk tulang, jantung, dan mungkin juga otak. Dalam melakukan kerjanya, estrogen membutuhkan reseptor estrogen (ERs) yang dapat “on/off” di bawah kendali gen pada kromosom yang disebut _-ER. Beberapa target organ seperti pertumbuhan dada, tulang, dan empedu responsif terhadap _-ER tersebut. Isoflavon, khususnya genistein, dapat terikat dengan _-ER. Walaupun ikatannya lemah, tetapi dengan β-ER mempunyai ikatan sama dengan estrogen. Senyawa isoflavon terbukti mempunyai efek hormonal, khususnya efek estrogenik. Efek estrogenik ini terkait dengan struktur isoflavon yang dapat ditransformasikan menjadi equol. Dimana equol mempunyai struktur fenolik yang mirip dengan hormon estrogen. Mengingat hormon estrogen berpengaruh pula terhadap metabolisme tulang, terutama proses kalsifikasi, maka adanya isoflavon yang bersifat estrogenik dapat berpengaruh terhadap berlangsungnya proses kalsifikasi. Dengan kata lain, isoflavon dapat melindungi proses osteoporosis pada tulang sehingga tulang tetap padat dan masif.


g. Anti kolesterol
Efek isoflavon terhadap penurunan kolesterol terbukti tidak saja pada hewan percobaan seperti tikus dan kelinci, tetapi juga manusia. Pada penelitian dengan menggunakan tepung kedelai sebagai perlakuan, menunjukkan bahwa tidak saja kolesterol yang menurun, tetapi juga trigliserida VLDL (very low density lipoprotein) dan LDL (low density lipoprotein). Di sisi lain, tepung kedelai dapat meningkatkan HDL (high density lipoprotein) (Amirthaveni dan Vijayalakshmi, 2000). Mekanisme lain penurunan kolesterol oleh isoflavon dijelaskan melalui pengaruh peningkatan katabolisme sel lemak untuk pembentukan energi yang berakibat pada penurunan kandungan kolesterol.
















JURNAL KIMIA 6 (1), JANUARI 2012 : 72-78

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN FLAVONOID
DARI MADU KELENGKENG (Nephelium longata L.)
Ida Ayu Raka Astiti Asih, Ketut Ratnayani, dan Ida Bagus Swardana
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran

ABSTRAK
            Telah dilakukan penentuan aktivitas antiradikal bebas dengan metode DPPH pada madu kelengkeng (Nephelium longata L.) secara spektrofotometri UV-Vis serta penggolongan senyawa kimia dalam fraksi non polar dan semi polar. Sebelumnya madu dimaserasi dengan metanol kemudian dipartisi dengan pelarut n-heksana dan etil asetat. Selanjutnya diukur aktivitas antiradikal bebasnya melalui serapan absorbansi pada panjang gelombang (λ) 497 nm, 517 nm, dan 537 nm pada konsentrasi DPPH antara lain: 0,001%, 0,002%, 0,003%, dan 0,004%. Kemudian pada masing-masing fraksi ditentukan golongan senyawa kimianya melalui uji fitokimia.
            Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat diduga mengandung senyawa golongan isoflavon, sedangkan aktivitas antiradikal bebas pada fraksi semi polar lebih besar daripada fraksi non polar dalam hal ini sebesar 91,71% dan 77,68% pada konsentrasi DPPH 0,001% (b/v). Hal ini menunjukkan bahwa pada fraksi semi polar lebih banyak mengandung komponen antiradikal bebas.
Kata Kunci : madu kelengkeng, aktivitas antiradikal bebas, metode DPPH, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat






ABSTRACT
            The determination of anti free radical activity on longan honey (Nephelium longata L.) by DPPH method using UV-Vis sphectrophotometry and identification of chemical compound in non polar and semi polar fraction have been done. Longan honey was diluted with methanol and then partied by n-hexane and ethyl acetate. The absorbance was measured at 497 nm, 517 nm, and 537 nm for the DPPH concentration of : 0,001%, 0,002%, 0,003%, and 0,004% and the chemical compound was identified by phytochemical method.
            The result showed that part of n-hexane and ethyl acetate probably consist of chemical compound of isoflavone and value of anti free radical activity on longan honey in semi polar fraction was higher than in non polar fraction which were 91,71% and 77,68% at DPPH concentration of 0,001% (b/v).
Keywords : longan honey, free antiradical activity, DPPH method, n-hexane fraction, ethyl acetate fraction











PENDAHULUAN
            Telah kita ketahui bahwa kesehatan merupakan modal dasar yang paling penting dalam kehidupan manusia. Tanpa kesehatan yang optimal maka segala pekerjaan akan terhambat bahkan tertunda sama sekali. Negara dengan mayoritas penduduk berusia panjang telah banyak diketahui bahwa mereka mengkonsumsi makanan yang kaya akan kacang-kacangan, sayur-sayuran, dan buah-buahan. Hal ini mengkaitkan bahwa kesehatan erat hubungannya dengan gaya hidup dan kualitas hidup manusia (National Geographic Indonesia, 2005).
            Inilah yang memotivasi para peneliti pangan dan gizi untuk mengeksplorasi senyawa-senyawa alami yang dapat menunda, menghambat, dan mencegah proses oksidasi atau terjadinya reaksi antioksidasi radikal bebas di tubuh kita yang diketahui sebagai salah satu penyebab rusak atau matinya sel-sel di dalam tubuh kita. Karena tanpa disadari dalam tubuh kita terus-menerus terbentuk radikal bebas melalui peristiwa metabolisme sel normal, peradangan, kekurangan gizi, dan akibat respon terhadap pengaruh dari luar tubuh seperti polusi, sinar ultraviolet, dan asap rokok. Akibat yang ditimbulkan oleh lingkungan tercemar, kesalahan gaya hidup akan merangsang tumbuhnya radikal bebas yang dapat merusak tubuh kita (Anonim, 2008).
            Salah satu aplikasi produk alami yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber antiradikal adalah madu. Madu merupakan produk organik yang dihasilkan oleh lebah madu. Madu memiliki potensi dalam menghambat kelajuan dari pertumbuhan bakteri penyebab infeksi (Siddiqa, 2008). Kandungan nutrisi dalam madu yang berfungsi sebagai antiradikal adalah beberapa vitamin seperti vitamin A, vitamin C, vitamin E, flavonoid, dan sebagainya. (Gheldof, 2002).
            Madu kelengkeng diproduksi secara kontinyu di Indonesia. Di mana jenis madu ini berasal dari jenis bunga yaitu bunga kelengkeng, yang diketahui mempunyai khasiat yang sangat baik bagi kesehatan. Telah diteliti bahwa madu kelengkeng memiliki aktivitas antiradikal bebas sebesar 82,10% lebih besar dibandingkan dengan madu randu yaitu 69,37% untuk tiap 1 gram ekstrak pekat metanol yang diteliti (Ana, 2010). Melihat dari publikasi di Indonesia tentang madu kelengkeng yang masih terbatas terutama tentang aktivitas antiradikal bebas pada kondisi pelarut yang berbeda maka perlu dilakukan penelitian untuk mencari perbandingan aktivitas antiradikal bebas pada madu kelengkeng dalam pelarut non polar dan semi polar. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah n-heksan dan etil asetat yang merupakan pelarut umum dalam penelitian kimia. Pengukuran perbandingan aktivitas antiradikal bebas akan dilakukan secara spektrofotometri UV-Vis dengan metode yang sudah baku, sederhana, serta memerlukan sedikit sampel yaitu menggunakan metode DPPH (1,1-difenil 2-pikiril hidrazil) dimana perubahan warna yang khas dari senyawa ini dapat juga diamati secara visual (Blois, 1958).

















MATERI DAN METODE
1. Bahan
            Bahan-bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini adalah : metanol (CH3OH), etil asetat (CH3COOC2H5), n-heksana (C6H14), akuades (H2O), kristal difenil pikril hidrazil (DPPH), pereaksi Wilstater (HCl + logam Mg), Natrium Hidroksida (NaOH) 10%, asam sulfat (H2SO4) 10%, dan sampel madu kelengkeng.
2. Peralatan
            Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : seperangkat alat gelas, neraca analitik, labu ukur 10 mL, pipet ukur 1 mL dan 2 mL, corong pisah 1000 mL, stop watch, penguap putar vakum, spektrofotometer UV-Vis (UV-1601 Shimadzu).
3. Cara Kerja
a. Penyiapan sampel.
            Sampel madu kelengkeng yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari hasil peternakan lebah monofloral dari pohon kelengkeng dimana kualitas madunya sudah memenuhi Standar Industri Indonesia (SII).
b. Ekstraksi sampel madu kelengkeng
Sebanyak 250 mL sampel madu kelengkeng ditambahkan dengan metanol sampai semua sampel madu terendam dalam pelarut selama ±24 jam, selanjutnya filtrat disaring dan diuapkan pada tekanan rendah menggunakan penguap putar vakum hingga diperoleh ekstrak kental metanol kemudian dilarutkan dengan pelarut metanol:air (7:3) kemudian dipekatkan, lalu dipartisi dengan n-heksan sebanyak 100 mL, kemudian fraksi tersebut dipartisi dengan etil asetat sebanyak 100 mL kemudian masing-masing dipekatkan sehingga diperoleh fraksi n-heksana dan fraksi etil asetat yang masing-masing dilakukan uji fitokimia.
c. Penentuan aktivitas antiradikal bebas dengan spektroskopi
            Penentuan aktivitas antiradikal bebas dari ketiga fraksi yang diperoleh dari langkah awal kemudian dikerjakan dengan beberapa tahap sebagai berikut :
1.  Pengenceran sampel madu
            Sebanyak 0,08 gram dari setiap fraksi diencerkaan dengan metanol pada labu ukur 10 mL hingga kadarnya 8000 ppm.
2.  Pembuatan larutan DPPH
            Kristal DPPH ditimbang sebanyak 0,004 gram kemudian dilarutkan dengan metanol dengan labu ukur tepat 100 mL sehingga kadarnya 0,004% (b/v) lalu diencerkan menjadi 0,001%, 0,002%, dan 0,003%.
3. Pengujian aktivitas antiradikal bebas
  • Pengukuran absorbansi DPPH :
            Spektra absorbansi DPPH diukur pada panjang gelombang yaitu 400-700 nm. Larutan blanko yang digunakan dalam setiap pengukuran adalah metanol. Pencatatan hasil dilakukan pada tiga panjang gelombang yaitu 497 nm, 517 nm, dan 537 nm untuk DPPH.
  • Pengukuran absorbansi sampel madu pada ketiga fraksi
            Sejumlah 1 mL madu pada masing-masing fraksi langsung dimasukkan ke dalam kuvet lalu ditambahkan 2 mL larutan DPPH 0,004%. Campuran tersebut kemudian diaduk rata dengan menggunakan pipet. Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 497 nm, 517 nm, dan 537 nm dilakukan pada menit ke-5 dan ke-60. Demikian juga dilakukan pada konsentrasi DPPH yang lain (Djatmiko, 1998).
d.  Uji fitokimia
            Fraksi non polar (n-heksan) dan fraksi semi polar (etil asetat) yang diperoleh diuji dengan pereaksi tetes golongan kemudian dicatat perubahan warnanya. Pereaksi yang digunakan antara lain larutan NaOH 10 %, H2SO4 pekat, serta HCl dan logam Mg.




HASIL DAN PEMBAHASAN
            Madu mengandung beragam senyawa antiradikal bebas seperti flavonoid, beta karoten, dan vitamin C. Dalam penelitian ini, penentuan aktivitas antiradikal bebas madu ditentukan melalui metode DPPH. Metode DPPH dipilih karena sederhana, mudah cepat, dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel (Blois, 1958). Sampel madu yang digunakan adalah madu kelengkeng. Madu kelengkeng berasal dari nektar bunga dari pohon kelengkeng (madu monoflora) sehingga memiliki wangi, warna, dan rasa yang spesifik sesuai dengan sumbernya (Suranto, 2007). Sampel madu dipilih telah dilabel SII untuk menghindari kesalahan dari penggunaan madu palsu.
a. Ekstraksi madu kelengkeng
            Sampel madu kelengkeng ditimbang sebanyak 350,61 gram (250 mL) dimaserasi dengan metanol kira-kira sebanyak 1 Liter (atau hingga sampel madu terendam) selama 24 jam. Ekstraksi dengan teknik maserasi dipilih karena lebih sederhana juga di dalam sampel madu banyak mengandung gula serta metabolit sekunder yang dapat rusak karena adanya pemanasan hal ini terbukti saat dilakukan hidrolisis gula (pemutusan aglikon) dengan menggunakan sokhlet maka sampel madu menjadi berwarna coklat gelap dimana sampel tersebut menjadi rusak sehingga pada penelitian ini metode tersebut tidak dilakukan. Setelah 24 jam bagian dasar wadah terbentuk lapisan berwarna putih. Bagian atas madu diambil untuk dipartisi. Pemisahan dengan metode partisi akan menghasilkan pemisahan cairan sesuai dengan sifat kepolaran cairaan.
            Bagian atas hasil maserasi dipekatkan dengan menggunakan penguap vakum putar hingga sampel madu mengental dan diperoleh ekstrak kental metanol yang berwarna coklat kemerahan. Kemudian ditambahkan 100 mL metanol-air (7:3) kemudian diuapkan. Ekstrak kental metanol-air tersebut dipartisi dalam dua tahap yaitu dengan n-heksan dan selanjutnya dengan etil asetat. Kedua pelarut ini digunakan dalam partisi selain memiliki sifat dasar yang berbeda yaitu non polar (n-heksan) dan semi polar (etil asetat) pelarut ini juga dapat dijangkau dari segi penggadaan dan harga. Partisi tahap pertama yaitu dengan n-heksan sebanyak 100 mL sehingga diperoleh dua lapisan yaitu lapisan bagian atas adalah n-heksan dan lapisan bawah adalah metanol-air. Setelah dilakukan pemisahan sebanyak dua kali dan dilakukan pemekatan dengan menggunakan penguap vakum putar maka diperoleh ekstrak kental n-heksana berwarna bening sedikit lengket sebanyak 0,20 gram. Ektrak kental metanol-air juga dipartisi selanjutnya dengan menggunakan etil asetat sebanyak 100 mL sehingga diperoleh dua lapisan yaitu lapisan bagian atas adalah etil asetat dan bagian bawah adalah metanol-air. Setelah dilakukan pemisahan sebanyak dua kali dan dilakukan pemekatan dengan menggunakan penguap vakum putar maka diperoleh ekstrak kental etil asetat berwarna kuning sebanyak 13,94 gram. Ekstrak kental metanol-air (7:3) dengan lapisan atas berwarna lebih muda dan akan berangsur-angsur berwarna coklat muda setelah didiamkan beberapa saat. Hal ini disebabkan karena masih ada distribusi partikel-partikel menuju kesetimbangan sesuai dengan sifat kepolaran masing-masing.
            Hasil ekstrak yang diukur aktivitas antiradikal bebasnya adalah fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat saja karena fraksi air yang diperoleh berupa lapisan lengket berwarna cokelat gelap yang lengket dan mengeras. Ekstrak metanol-air (7:3) yang mengandung sampel madu dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak kental sebanyak 179,45 gram yang adalah lapisan lengket yang mengandung komponen-komponen kimia yang tidak mudah larut ke dalam n-heksan maupun etil asetat.
b. Penentuan aktivitas antiradical bebas secara spektroskopi
            Spektrofotometri ultraviolet-tampak adalah salah satu teknik analisis yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dengan panjang gelombang (λ) 190-380 nm dan sinar tampak pada panjang gelombang (λ) 380-780 nm. Serapan cahaya oleh suatu molekul dalam daerah spektrum UV-vis sangat bergantung pada struktur elektronik dari molekul (Hardjono, 1991). Pengukuran antiradikal bebas dengan metode DPPH sebagai senyawa radikal bebas stabil yang ditetapkan secara spektrofotometri merupakan prosedur sederhana untuk mengukur aktivitas antiradikal. Radikal DPPH adalah suatu senyawa organik yang mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada λmaks 517 nm dan berwarna ungu gelap. Setelah bereaksi dengan senyawa antiradikal maka DPPH tersebut akan tereduksi dan warnanya akan berubah menjadi kuning. Perubahan warna tersebut disebabkan karena berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH karena adanya penangkapan satu elektron oleh zat antiradikal yang menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut untuk beresonansi dimana perubahan ini dapat diukur dan dicatat dengan spektrofotometer.
            Dua jenis ekstrak kental dari fraksi n-heksana dan fraksi etil asetat diuji aktivitas antiradikal bebas secara spektroskopi menggunakan senyawa DPPH. Pada tingkat konsentarasi yang berbeda dari DPPH yaitu 0,001%, 0,002%, 0,003%, dan 0,004% yang berwarna ungu sehingga besarnya aktivitas antiradikal bebas pada kedua jenis fraksi tersebut dapat diukur sebagai % peredaman melalui rumus sebagai berikut :
% peredaman DPPH=
rumus persen perendaman DPPH
Adapun absorbansi hitung DPPH atau sampel pada puncak 517 nm dapat dihitung melalui rumus sebagai berikut :
c. Absorbansi hitung DPPH atau sampel
rumus absorbansi hitung DPPH
            Nilai 0% berarti tidak mempunyai keaktivan sebagai antiradikal bebas, 100 % berarti peredaman total. Suatu bahan dikatakan aktif sebagai antiradikal bebas bila persentase peredamannya lebih dari atau sama dengan 50% (Djatmiko, 1998). Dari hasil perhitungan pada maka diperoleh data seperti tampak padaTabel1. Pengukuran % peredaman dengan menggunakan konsentrasi DPPH yang beragam diterapkan untuk menguatkan data perbandingan aktivitas antiradikal bebas pada fraksi non polar (n-heksana) dan fraksi semi polar (etil asetat). Sehingga dari hasil perhitungan Tabel 1 menunjukkan bahwa baik dari fraksi n-heksan maupun fraksi etil asetat dari madu kelengkeng memiliki presentase peredaman setelah 60 menit di atas 50% (kecuali pada fraksi n-heksana pada peredaman DPPH 0,004%) dimana perbandingan pada konsentrasi DPPH 0,001% menunjukkan perbandingan yang nyata. Sehingga dapat diketahui bahwa sampel madu kelengkeng mengandung bahan aktif antiradikal bebas. Dimana pada fraksi semi polar lebih tinggi dalam meredam radikal bebas dibandingkan pada fraksi non polar. Sehingga terlihat jelas bahwa komponen-komponen kimia antiradikal bebas lebih banyak terdistribusi ke fraksi semi polar dibandingkan dengan fraksi non polar hal ini disebabkan bahwa pada madu kelengkeng banyak mengandung metabolit sekunder yang bersifat cenderung bersifat semi polar atau polar. Dimana senyawa-senyawa kimia pada fraksi semi polar seperti golongan isoflavon selain memiliki ikatan rangkap majemuk juga memiliki gugus hidroksi lebih banyak yang dapat berpotensi untuk meredam radikal DPPH. Perhitungan % peredaman dapat dilihat pada Tabel 2-4 sedangkan hasil perbandingan ini dapat dilihat pada Gambar 1.
Perbandingan persen peredaman radikal bebas pada fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana
Gambar 1. Perbandingan persen peredaman radikal bebas pada fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana
d. Uji fitokimia ekstrak kental hasil partisi
            Uji warna merupakan suatu metode kualitatif untuk menentukan keberadaan suatu antiradikal dengan mereaksikan suatu sampel dengan reaktan tertentu sehingga menunjukkan sifat fisik berupa perubahan warna tertentu sebagai indikator. Ekstrak kental dari fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat diuji fitokimia melalui reaksi warna dengan beberapa pelarut sehingga diperoleh data seperti pada Tabel 1. Berdasarkan Tabel 1 dan juga dengan membandingkan data uji fitokimia pada literatur dapat disimpulkan bahwa pada fraksi n-heksana dan fraksi etil asetat terjadi perubahan warna yang khas sehingga diduga mengandung senyawa kimia golongan flavonoid khususnya isoflavon.
Tabel 1. Uji fitokimia dari fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat madu
No.
Uji fitokimia
Pereaksi yang ditambahkan
Perubahan warna
Kesimpulan
1
Steroid
H2SO4 10%
Bening→ungu
-
2
Flavonoid
NaOH 10%
HCl+logam Mg
HCl+dipanaskan
Bening→kuning
Bening→kuning
Bening→kuning
+
+
+
3
Saponin
Air panas+HCl
Tidak terbentuk busa
-
4
Asam fenolat
FeCl3 1%
Bening→ungu
-

Tabel 2. Hasil perhitungan persentase peredaman DPPH 0,001% (b/v)
Sampel
Waktu
(menit)
Uji
Absorbansi A
A hitung
517 nm
Perendaman
497
nm
517
nm
537
nm
1
5
5
DPPH
Sampel
0,0736
0,0703
0,0838
0,0778
0.0717
0,0649
0,0112
0,0102
8,93%
60
60
DPPH
Sampel
0,1302
0,0607
0,1524
0,0673
0,1336
0,0574
0,0205
0,0085
58,54%
2
5
5
DPPH
Sampel
0,0736
0,0396
0,0838
0,0352
0,0717
0,0258
0,0112
0,0025
77,68%
60
60
DPPH
Sampel
0,1302
0,0204
0,1524
0,0190
0,1336
0,0142
0,0205
0,0017
91,71%
Tabel 3. Hasil perhitungan persentase peredaman DPPH 0,002% (b/v)
Sampel
Waktu
(menit)
Uji
Absorbansi A
A hitung
517 nm
Perendaman
497
nm
517
nm
537
nm
1
5
5
DPPH
Sampel
0,1473
0,1399
0,1677
0,1541
0,1434
0,1300
0,0223
0,0191
14,35%
60
60
DPPH
Sampel
0,2604
0,1241
0,3048
0,1399
0,2673
0,1169
0,0410
0,0194
52,69%
2
5
5
DPPH
Sampel
0,1473
0,0979
0,1677
0,1012
0,1434
0,0825
0,0223
0,0110
50,73%
60
60
DPPH
Sampel
0,2604
0,0686
0,3048
0,0712
0,2673
0,0587
0,0410
0,0076
81,47%
Tabel 4. Hasil perhitungan persentase peredaman DPPH 0,004 % (b/v)
Sampel
Waktu
(menit)
Uji
Absorbansi A
A hitung
517 nm
Perendaman
497
nm
517
nm
537
nm
1
5
5
DPPH
Sampel
0,2946
0,3125
0,3354
0,3390
0,2868
0,2892
0,0447
0,0382
14,54%
60
60
DPPH
Sampel
0,5208
0,2827
0,6096
0,3232
0,5346
0,2760
0,0819
0,0438
46,52%
2
5
5
DPPH
Sampel
0,2946
0,2501
0,3354
0,2599
0,2868
0,2151
0,0447
0,0273
38,93%
60
60
DPPH
Sampel
0,5208
0,1948
0,6096
0,2147
0,5346
0,1827
0,0819
0,0259
68,38%


Katerangan :
 1 = Ekstrak kental n-heksan sampel madu
 2 = Ekstrak kental etil asetat sampel madu

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
  1. Madu kelengkeng memiliki aktivitas antiradikal bebas yang lebih besar pada fraksi etil asetat yaitu sebesar 91,71% dibandingkan pada fraksi n-heksan sebesar 58,54% untuk konsentrasi DPPH 0,001% (b/v).
  2. Dari uji fitokimia fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat dari madu kelengkeng maka dapat diamati bahwa madu tersebut diduga mengandung senyawa aktif antiradikal bebas golongan isoflavon.
Saran
            Dari penelitian ini diperoleh terdapat beberapa hal menarik untuk diteliti lebih lanjut, yaitu Saran dari penelitian ini adalah perlu dilakukan fariasi konsentrasi sampel untuk membandingkan peredaman radikal bebas DPPH dan juga dapat dilakukan analisis lebih lanjut dengan teknik spektroskopi sehingga dapat diketahui struktur molekul dari senyawa kimia yang memiliki aktivitas antiradikal bebas tersebut.





BAB III
KESIMPULAN
Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok fenol yang terbesar yang ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu dan biru dan sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoid merupakan pigmen tumbuhan dengan warna kuning, kuning jeruk, dan merah dapat ditemukan pada buah, sayuran, kacang, biji, batang, bunga, herba, rempah-rempah, serta produk pangan dan obat dari tumbuhan seperti minyak zaitun, teh, cokelat, anggur merah, dan obat herbal. Flavonoid juga dikenal sebagai vitamin P dan citrin, dan merupakan pigmen yang diproduksi oleh sejumlah tanaman sebagai warna pada bunga yang dihasilkan. Bagian tanaman yang bertugas untuk memproduksi flavonoid adalah bagian akar yang dibantu oleh rhizobia, bakteri tanah yang bertugas untuk menjaga dan memperbaiki kandungan nitrogen dalam tanah.
 Senyawa ini berperan penting dalam menentukan warna, rasa, bau, serta kualitas nutrisi makanan. Tumbuhan umumnya hanya menghasilkan senyawa flavonoid tertentu. Keberadaan flavonoid pada tingkat spesies, genus atau familia menunjukkan proses evolusi yang terjadi sepanjang sejarah hidupnya.
 Isolasi dan Identifikasi Flavonoid secara umum
¢  Isolasi Dengan metanol
¢  Isolasi Dengan Charaux Paris
¢  Isolasi dengan beberapa pelarut.
¢  Identifikasi Dengan Reaksi warna
Ø Uji WILSTATER
Ø Uji BATE SMITH MATECALVE
          Identifikasi flavonoid
Prosedur Isolasi dan Identifikasi senyawa Flavonoid dari Madu Kelengkeng :
¢  Penyiapan sampel
¢  Ekstraksi sampel madu kelengkeng
¢  Penentuan aktivitas antiradikal bebas dengan spektroskopi
Ø  Pengenceran sampel madu
Ø  Pembuatan larutan DPPH
Ø  Pengujian aktivitas antiradikal bebas
¢  Uji fitokimia
DAFTAR PUSTAKA